Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung
Summary
Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine Methode, die eine effektive Abgabe von Therapeutika in das Gehirn durch direkte Perfusion großer Gewebevolumina ermöglicht. Das Verfahren erfordert den Einsatz von Kathetern und ein optimiertes Injektionsverfahren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik für CED eines Antikörpers in ein Maushirn.
Abstract
Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine neurochirurgische Technik, die eine effektive Perfusion großer Gehirnvolumina mit einem Kathetersystem ermöglicht. Ein solcher Ansatz bietet eine sichere Abgabemethode, die die Blut-Hirn-Schranke (BBB) passiert, wodurch eine Behandlung mit Therapeutika mit schlechter BBB-Permeabilität oder solchen, bei denen eine systemische Exposition nicht erwünscht ist, z. B. aufgrund von Toxizität, ermöglicht wird. CED erfordert eine Optimierung des Katheterdesigns, des Injektionsprotokolls und der Eigenschaften des Infusaten. Mit diesem Protokoll beschreiben wir, wie CED einer Lösung durchgeführt wird, die bis zu 20 g eines Antikörpers in das Caudate-Putamen von Mäusen enthält. Es beschreibt die Vorbereitung von Stepkathetern, deren Testung in vitro und die Durchführung des CED bei Mäusen mit einem Hochlauf-Injektionsprogramm. Das Protokoll kann leicht auf andere Infusionsvolumina eingestellt werden und kann zur Injektion verschiedener Tracer oder pharmakologisch aktiver oder inaktiver Substanzen, einschließlich Chemotherapeutika, Zytokinen, Viruspartikeln und Liposomen, verwendet werden.
Introduction
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) bildet eine halbdurchlässige Grenze, die das zentrale Nervensystem (ZNS) von der Durchblutung trennt. Das Erreichen des ZNS mit Therapeutika ist jedoch im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten notwendig, wie Hirntumoren, Alzheimer -Krankheit (AD) oder Parkinson (PD) unter anderem1. Dies wird wichtig bei der Entwicklung neuer Therapien, vor allem, wenn das getestete Medikament eine schlechte BBB-Permeabilität aufweist oder seine systemische Exposition zu gefährlicher Toxizität führen kann1,2. Einige der klinisch verwendeten Antikörper zeigen beide Eigenschaften. Eine Lösung für dieses Problem wäre die Bereitstellung der Therapeutika direkt hinter der BBB.
Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine neurochirurgische Technik, die eine effektive Perfusion großer Gehirnvolumina ermöglicht. Dies wird durch die chirurgische Installation eines oder mehreren Katheter im Zielbereich erreicht. Während der Wirkstoffanwendung bildet sich bei der Öffnung des Katheters ein Druckgradient, der zur treibenden Kraft der Infusatendispersion im Gewebe3,4wird. Es ist also die Dauer der Infusion und nicht die Diffusionskoeffizienten, die den Durchfusionsbereich2,4,5bestimmen. Dies ermöglicht eine gleichmäßige Abgabe des Infusatübereinens über ein viel größeres Gehirnvolumen im Vergleich zu herkömmlichen, diffusionsbasierten intracerebralen Injektionsmethoden2,6. Gleichzeitig hat diese Abgabemodalität ein geringeres Risiko von Gewebeschäden2. Dementsprechend kann CED eine sichere und wirksame Verabreichung konventioneller Chemotherapeutika zur Behandlung von ZNS-Tumoren sowie die Abgabe von immunmodulatorischen Wirkstoffen oder agonistischen und antagonistischen Antikörpern bei einer Vielzahl anderer ZNS-Erkrankungen ermöglichen2 ,7,8,9. CED wird derzeit in Therapien der Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, sowie high-Grade-Gliom2,7,8,10,11getestet.
Katheter-Design und das Injektionsschema gehören zu den wichtigsten Faktoren, die das Ergebnis von CED 10,12,13,14,15,16beeinflussen. Darüber hinaus erfordert es spezifische physikalisch-chemische Eigenschaften des Infusaten, einschließlich der moderaten Größe der Partikel, eine anionische Ladung und geringe Gewebeaffinität 10,17. Jeder dieser Parameter muss potenziell an die histologischen Merkmale der Hirnregion angepasst werden, umanvisiertzu werden 2,10,17.
Hier beschreiben wir die Methodik zur Durchführung von CED einer Antikörperlösung in das Caudate Putamen (Striatum) von Mäusen. Darüber hinaus umfasst das Protokoll die Vorbereitung von Schrittkathetern in einem Laboraufbau, deren Prüfung in vitro und die Durchführung des CED.
Es gibt mehrere Katheter-Designs in der Literatur, die sich durch die Form der Kanüle, die verwendeten Materialien und die Anzahl der Katheteröffnungen12,15,18,19,20 unterscheiden ,21,22. Wir verwenden einen Stufenkatheter aus einer geschmolzenen Kieselsäurekapillare, die 1 mm aus einer stumpfen Metallnadel herausragt. Dieses Katheter-Design kann leicht in einem Forschungslabor hergestellt werden und liefert reproduzierbar gute CED-Ergebnisse, wenn es in vitro mit Agarose-Blöcken mit physikalischen Parametern getestet wird, die dem Gehirnparenchym in vivo23ähneln.
Darüber hinaus implementieren wir ein Ramping-Regime für die Bereitstellung von 5 L Infusate in vivo. In einem solchen Protokoll wird die Injektionsrate von 0,2 l/min auf maximal 0,8 l/min erhöht, wodurch die Wahrscheinlichkeit eines infusaten Refluxs entlang des Katheters sowie das Risiko einer Gewebeschädigung16minimiert wird. Mit diesem Protokoll haben wir im Laufe von 11 min 30 s erfolgreich Mäuse mit bis zu 20 g Antikörpern in 5 l PBS verabreicht.
Das Protokoll kann leicht für andere Infusionsvolumina oder für die Injektion verschiedener anderer Substanzen, z.B. Chemotherapeutika, Zytokine, Viruspartikel oder Liposomen2,10,14,18, ,22. Bei verwendung von Infusate mit drastisch unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zu einer Phosphatgepufferten Saline (PBS) oder einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) Lösung von Antikörpern werden zusätzliche Validierungsschritte empfohlen. Für Kathetermontage, Validierung und CED beschreiben wir alle Schritte mit einem stereotaktischen Roboter mit einer Bohr- und Einspritzeinheit, die auf einem normalen stereotaktischen Rahmen montiert ist. Dieses Verfahren kann auch mit einem manuellen stereotaktischen Rahmen durchgeführt werden, der mit einer programmierbaren Mikroinfusionspumpe verbunden ist, die die beschriebenen Glasmikrospritzen antreiben kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konvektionsverstärkte Abgabe, oder druckvermittelte Medikamenteninfusion in das Gehirn, wurde erstmals Infusion entost3vorgeschlagen. Dieser Ansatz verspricht Perfusion von großen Gehirnvolumen hinter der Blut-Hirn-Schranke in einer kontrollierten Weise2. Bisher wurden jedoch nur wenige klinische Studien mit diesem Ansatz durchgeführt, teilweise weil CED in einem klinischen Setup sich als technisch anspruchsvoll24,25</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt wurde diese Arbeit durch Stipendien der Universität Zürich (FK-15-057), der Novartis Stiftung für medizinisch-biologische Forschung (16C231) und der Schweizer Krebsforschung (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) an Johannes vom Berg und BRIDGE Proof of Concept (20B1-1 _177300) an Linda Schellhammer.
Materials
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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