منصة ميكروفلويديك لتحفيز الخلايا الغضروفية مع الضغط الديناميكي
Summary
توفر هذه المقالة طرق مفصلة لتلفيق وتوصيف جهاز microfluidic التشغيل الهوائي لضغط الخلايا الغضروفية.
Abstract
ومن المعروف أن المحفزات الميكانيكية لتعديل الوظائف البيولوجية للخلايا والأنسجة. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن الإجهاد الضاغط يغير بنية غضروف لوحة النمو والنتائج في تعديل النمو من عظام طويلة من الأطفال. لتحديد دور الإجهاد الضاغط في نمو العظام، أنشأنا جهاز microfluidic تعمل بواسطة الضغط الهوائي، لضغط ديناميكيا (أو ثابت) خلايا chondrocytes لوحة النمو جزءا لا يتجزأ من اسطوانات هيدروجيل الجينات. في هذه المقالة، ونحن نصف الطرق التفصيلية لتلفيق وتميز هذا الجهاز. مزايا بروتوكولنا هي: 1) خمسة أحجام مختلفة من الإجهاد الضغط يمكن أن تولد على خمسة تكرارات التقنية في منصة واحدة، 2) فمن السهل تصور مورفولوجيا الخلية عن طريق المجهر الضوء التقليدي، 3) يمكن عزل الخلايا بسرعة من الجهاز بعد الضغط لتسهيل الاختبارات المصب، و 4) يمكن تطبيق منصة لدراسة الميكانيكية من أي نوع الخلية التي يمكن أن تنمو في هيدروجيلس.
Introduction
المنصات ذات الهندسة الدقيقة هي أدوات قيمة لدراسة البيولوجيا الجزيئية والخلوية ومستوى الأنسجة لأنها تمكن السيطرة الديناميكية على كل من البيئات الدقيقة الفيزيائية والكيميائية1،2،3 ،4،5،6،7،8. وهكذا، يمكن اختبار فرضيات متعددة في وقت واحد بطريقة تسيطر عليها بإحكام. في حالة نمو الغضروف لوحة، وهناك أدلة متزايدة على دور مهم من الإجهاد الضغط في تحوير نموالعظام من خلال العمل على نمو لوحة الغضروف9،10،11، 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21،22،23،24،25. ومع ذلك، فإن آلية عمل الإجهاد الضغطي – على وجه الخصوص، كيف يوجه الإجهاد تشكيل أعمدة الخلايا الغضروفية في لوحة النمو – غير مفهومة بشكل جيد.
والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء جهاز ضغط chondrocyte microfluidic تعمل هوائيا26 لتوضيح آليات الميكانيكا في الخلايا الغضروفية لوحة النمو (الشكل 1أ-ج). يتكون الجهاز من جزأين: وحدة التشغيل الهوائية وبنية هلام الجينات. يتم تصنيع وحدة التشغيل الهوائية microfluidic باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) على أساس التصوير والطباعة الحجرية الناعمة. تحتوي هذه الوحدة على مجموعة 5 × 5 من بالونات غشاء PDMS رقيقة والتي يمكن تضخيمها بشكل مختلف على أساس أقطارها. يتكون بناء هلام الجينات من الخلايا الغضروفية المضمنة في مجموعة 5 × 5 من اسطوانات هلام الجينات، ويتم تجميع بنيات الجينات والخلايا الغضروفية بأكملها مع وحدة التدجين. يتم ضغط المنشآت هلام الجينات بواسطة بالونات PDMS تضخم هوائيا(الشكل 1b). الجهاز microfluidic يمكن أن تولد خمسة مستويات مختلفة من الإجهاد الضغط في وقت واحد في منصة واحدة على أساس الاختلافات في قطر بالون PDMS. وهكذا، من الممكن إجراء اختبار عالي الإنتاجية للميكنة في الخلايا الغضروفية في ظل ظروف ضغط متعددة.
الجهاز microfluidic الموصوفة في هذا البروتوكول لديها العديد من المزايا على جهاز الضغط التقليدية مثل المثبتات الخارجية14،21،23 وأجهزة الضغط العيانية16، 19 سنة , 27 , 28 لدراسة الميكانيكا chondrocyte: 1) الجهاز microfluidic فعالة من حيث التكلفة لأنه يستهلك حجم أصغر من العينات من جهاز ضغط العيان، 2) الجهاز microfluidic هو الوقت الفعال لأنه يمكن اختبار متعددة ظروف الضغط في وقت واحد، 3) الجهاز microfluidic يمكن الجمع بين المحفزات الميكانيكية والكيميائية عن طريق تشكيل تدرج تركيز المواد الكيميائية على أساس خلط محدود في القنوات الدقيقة، و 4) تقنيات الفحص المجهري المختلفة (الفاصل الزمني يمكن تطبيق الفحص المجهري والفلورة المجهرية البؤرية) مع الجهاز microfluidic مصنوعة من PDMS شفافة.
اعتمدنا وعدلنا طريقة Moraes وآخرون7،29 لخلق مستويات ضغط مختلفة في جهاز واحد لتمكين الدراسات الميكانيكية عالية الإنتاجية من ضغط الخلايا الغضروفية. نهجنا مناسب للخلايا (على سبيل المثال، chondrocytes) التي تحتاج إلى بيئة ثقافية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وللاختبارات البيولوجية بعد ضغط الخلايا. على الرغم من أن بعض أجهزة ضغط الخلايا الدقيقة يمكن ضغط الخلايا المستزرعة على ثنائي الأبعاد (2D) ركائز30،31،32،لا يمكن استخدامها لchondrocytes لأن الخلايا الغضروفية المستزرعة 2D إزالة التمييز. هناك منصات microfluidic لضغط الخلايا المستزرعة 3D في هيدروجيلات ضوئية7،33، لكنها محدودة في عزل الخلايا بعد تجارب الضغط لأن عزل الخلايا من البلمرة الضوئية هيدروجيل ليس من السهل. وبالإضافة إلى ذلك، قد يلزم تقييم آثار التعرض للأشعة فوق البنفسجية وبادئات الربط بين الصور على الخلايا. وعلى النقيض من ذلك، تسمح طريقتنا بالعزل السريع للخلايا بعد تجارب الضغط لاختبارات ما بعد البيولوجيا لأن هيدروجيلات الجينات يمكن أن تكون منزوعة البوليمر بسرعة من قبل مخلب اتلاف الكالسيوم. ويرد في هذا البروتوكول وصف لأساليب تصنيع الأجهزة المفصلة وتوصيفها. يظهر في الشكل 2إجراء موجز لتلفيق جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لاختبار آثار الإجهاد الضاغط على الخلايا الغضروفية لوحة النمو، قمنا بتطوير جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة(الشكل 1)لتطبيق مستويات مختلفة من الإجهاد الضاغط على الخلايا الغضروفية في سقالة هيدروجيل الجينات ل3D الثقافة بطرق الإنتاجية العالية. لمساعدة الباحثين الآخرين على …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورين كريستوفر مورايس وستيفن أ. مورين على دعمهما لتصميم الأجهزة وتصنيعها. وقد تم دعم هذه الدراسة بمنحة الهندسة الحيوية للصحة البشرية من جامعة نبراسكا لينكولن (UNL) والمركز الطبي لجامعة نبراسكا (UNMC)، ومنحة AR070242 من المعهد الوطني للصحة/نظام المعلومات الوطني. نشكر جانيس أ. تايلور وجيمس ر. تالاسكا من المرفق الأساسي للميكروسكوب المتقدم في المركز الطبي لجامعة نبراسكا على تقديم المساعدة في الفحص المجهري البؤري.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
References
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
