동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼
Summary
이 문서에서는 연골 세포 압축을 위한 공압 작동 미세 유체 장치를 제조하고 특성화하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.
Abstract
기계적 자극은 세포와 조직의 생물학적 기능을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 연구는 압축 스트레스 성장 플레이트 연골 아키텍처를 변경 하 고 어린이의 긴 뼈의 성장 변조 결과 제안. 뼈 성장에 압축 응력의 역할을 결정하기 위해, 우리는 알긴산 하이드로 겔 실린더에 내장 된 동적으로 (또는 정적으로) 압축 성장 판 연골 세포에, 공압 압력에 의해 작동 미세 유체 장치를 만들었습니다. 이 문서에서는 이 장치를 조작하고 특성화하는 자세한 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜의 장점은 : 1) 압축 응력의 다섯 가지 크기는 하나의 플랫폼에서 다섯 개의 기술적 복제에 생성 될 수있다, 2) 기존의 빛 현미경을 통해 세포 형태를 시각화하기 쉽습니다, 3) 세포는 신속하게 분리 될 수있다 압축 후 디바이스로부터 다운스트림 어노세를 용이하게 하고, 4) 플랫폼은 하이드로겔에서 성장할 수 있는 임의의 세포 유형의 메카노생물학을 연구하기 위해 적용될 수 있다.
Introduction
마이크로 엔지니어링 플랫폼은 물리적 및 화학적 미세 환경모두의동적 제어를 가능하게하기 때문에 분자, 세포 및 조직 수준 생물학을 연구하기위한 귀중한 도구입니다1,2,3 ,4,5,6,7,8. 따라서, 여러 가설은 동시에 엄격하게 통제된 방식으로 시험될 수 있다. 성장판 연골의 경우,성장판 연골9,10,11에대한 작용을 통해 뼈 성장을 조절하는 데 있어 압축 스트레스의 중요한 역할에 대한 증거가 증가하고있다. 12,13,14,15,16 ,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. 그러나, 압축 응력의 작용의 메커니즘 – 특히, 스트레스가 성장 판에 연골 세포 기둥의 형성을 안내하는 방법 – 제대로 이해되지 않습니다.
이 프로토콜의 목적은 성장판 연골세포에서 메카노바이오틱의 메커니즘을 해명하기 위해 공압작동 미세유체 연골세포압축장치(26)를 만드는것이다(도 1a-c). 이 장치는 공압 작동 장치와 알긴산 겔 구조의 두 부분으로 구성됩니다. 미세 유체 공압 작동 장치는 사진 및 연리소그래피에 기초하여 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 제작됩니다. 이 장치에는 직경에 따라 다르게 팽창 할 수있는 얇은 PDMS 멤브레인 풍선의 5 x 5 배열이 포함되어 있습니다. 상기 알긴산 겔 구조는 5 x 5 배열의 알긴산 겔 실린더에 내장된 연골세포로 구성되며, 전체 알긴산-콘드로시트 구조는 작동 장치와 함께 조립된다. 알긴산 겔 구문은 공압적으로 팽창된 PDMS 풍선에 의해 압축된다(도1b). 미세 유체 장치는 PDMS 풍선 직경의 차이에 따라 단일 플랫폼에서 동시에 다섯 가지 수준의 압축 응력을 생성할 수 있습니다. 따라서, 다중 압축 조건 하에서 연골세포 메카노생물학의 고처리량 시험이 가능하다.
본 프로토콜에 기재된 미세유체 장치는 외부픽서(14,21,23 및 거시적 압축장치)와같은 종래의 압축 장치에 비해 많은 장점을갖는다. 19세 , 27세 , 28 연골세포 메카노생물학을 연구하기 위한: 1) 미세유체 장치는 거시적 압축 장치보다 적은 양의 샘플을 소비하기 때문에 비용 효과적이며, 2) 미세 유체 장치는 여러 개의 샘플을 테스트할 수 있기 때문에 시간 효율적입니다. 압축 조건 동시에, 3) 미세 유체 장치는 마이크로 채널의 제한된 혼합에 기초하여 화학 물질의 농도 구배를 형성하여 기계적 및 화학적 자극을 결합 할 수 있으며, 4) 다양한 현미경 기술 (시간 경과) 현미경 검사법 및 형광 공초점 현미경 검사법)은 투명 PDMS로 만들어진 미세 유체 장치로 적용 할 수 있습니다.
우리는 Moraes 등7,29의 방법을 채택하고 개정하여 연골 세포 압박의 고처리량 메카노생물학 연구를 가능하게하기 위해 단일 장치에서 다른 압축 응력 수준을 생성합니다. 우리의 접근법은 3차원(3D) 배양 환경을 필요로 하는 세포(예를 들어, 연골세포)와 세포를 압축한 후생물학적 세포학적 인 세포에 적합합니다. 일부 미세 유체 세포 압축 장치는 2 차원 (2D) 기판(30,31,32)에배양 된 세포를 압축 할 수 있지만 2D 배양 연골 세포이기 때문에 연골 세포에 사용할 수 없습니다. 차별화. 광중합체 하이드로겔7,33에서3D 배양 세포를 압축하기 위한 미세 유체 플랫폼이 있지만 광중합체로부터 세포를 분리하기 때문에 압축 실험 후 세포를 분리하는 데 제한이 있습니다. 하이드로겔은 쉽지 않습니다. 추가적으로, 세포에 자외선 (UV) 노출 및 사진 가교 개시자의 효력은 평가될 필요가 있을 지도 모릅니다. 대조적으로, 우리의 방법은 알긴산 하이드로겔이 칼슘 킬레이트에 의해 신속하게 중합될 수 있기 때문에 포스트 생물학적 분석실험에 대한 압축 실험 후 세포의 신속한 분리를 허용합니다. 자세한 장치 제작 및 특성화 방법은 이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 미세유체 연골세포 압축 장치를 제조하기 위한 간략한 절차는 도 2에나타내고 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성장판 연골세포에 대한 압축 응력의 영향을 테스트하기 위해 미세유체 연골세포 압축장치(그림 1)를개발하여 알긴산 하이드로겔 스캐폴드의 연골세포에 다양한 수준의 압축 스트레스를 3D로 적용했습니다. 처리량이 높은 방식으로 문화를 전달합니다. 다른 연구자가 장치를 채택하거나 유사한 장치를 개발할 수 있도록 이 프로토콜 문서에서 장치 제작 단계에 대한 세부 정?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
크리스토퍼 모라에스 박사와 스티븐 에이 모린 박사가 장치 설계 및 제작을 지원해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구 결과는 네브라스카 링컨 대학 (UNL)와 네브래스카 대학 의료 센터 (UNMC)에서 인간 건강 교부금을 위한 생명 공학에 의해 지원되고, NIH/NIAMS에서 AR070242를 부여했습니다. 우리는 공초점 현미경 검사법에 도움을 제공한 네브래스카 대학 의료 센터에 있는 고급 현미경 코어 시설의 제니스 A. 테일러와 제임스 R. Talaska에게 감사합니다.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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