Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien
Summary
Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.
Abstract
Die Parkinson-Krankheit (PD) wird durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM) verursacht. Zellersatztherapie hält große Versprechen für die Behandlung von PD. In letzter Zeit haben sich induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs) als potenzieller Kandidat für die Zellersatztherapie aufgrund des reduzierten Risikos der Tumorbildung und der Plastizität, die zu regionsspezifische Neuronen und Glia. iNSCs können aus autologen somatischen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen umprogrammiert werden. Im Vergleich zu anderen Arten von somatischen Zellen sind PBMNCs ein attraktiver Starterzellentyp, da der Zugriff auf die Kultur erleichtert und erweitert wird. Sendai Virus (SeV), ein nichtintegratives RNA-Virus, das Reprogramming-Faktoren wie humanoct3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC kodiert, hat ein negativ-sinnliches, einsträngiges, nicht segmentiertes Genom, das sich nicht in Wirtsgenom, sondern nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert, bietet ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, in dem iNSCs durch Neuprogrammierung von PBMNCs erhalten und durch eine zweistufige Methode in spezialisierte VM-DA-Neuronen differenziert werden. Dann werden DA-Vorläufer in einseitig 6-Hyroxydopamin (6-OHDA)-lsioned PD-Mausmodelle transplantiert, um die Sicherheit und Wirksamkeit für die Behandlung von PD zu bewerten. Diese Methode bietet eine Plattform, um die Funktionen und therapeutischen Wirkungen patientenspezifischer DA-Neuralzellen in vitro und in vivo zu untersuchen.
Introduction
Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM), mit einer Prävalenz von mehr als 1% in der Bevölkerung über 60 Jahre alt 1 , 2. In den letzten zehn Jahren hat die Zelltherapie, die darauf abzielt, entweder die degenerativen oder geschädigten Zellen zu ersetzen oder die Mikroumgebung um die degenerierenden Neuronen zu nähren, Potenzial bei der Behandlung von PD3gezeigt. Inzwischen hat die Umprogrammierungstechnologie signifikante Fortschritte gemacht4, die eine vielversprechende zelluläre Quelle für die Ersatztherapie bietet. Es hat sich gezeigt, dass sich humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und embryonale Stammzellen (ESCs) in DA-Neuralzellen differenzieren können, die überleben, reifen und die motorischen Funktionen verbessern könnten, wenn sie in Ratten- und nichtmenschliche Primaten-PD-Modelle eingepfropft werden5 ,6,7,8. iPSCs stellen einen Meilenstein in der zellulären Reprogrammierungstechnologie dar und haben ein großes Potenzial in der Zelltransplantation; Es besteht jedoch nach wie vor Bedenken hinsichtlich des Risikos einer Tumorbildung durch die unvollständig differenzierten Zellen. Eine alternative zelluläre Quelle für die Zelltransplantation sind abstammungsgebundene adulte Stammzellen, die durch direkte Reprogrammierung gewonnen werden, wie z. B. induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs), die aus den instabilen Zwischenprodukten abgeleitet werden können, um die Pluripotenz zu umgehen. Stufe9,10,11.
Sowohl iPSCs als auch iNSCs können aus autologen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen12,13,14umprogrammiert werden, wodurch die Immunogenität transplantierter Zellen in hohem Maße. Darüber hinaus sind iNSCs im Vergleich zu iPSCs mit einem reduzierten Risiko für Tumorbildung und liniengebundene Plastizität verbunden, die nur in der Lage sind, sich in Neuronen und Glia zu differenzieren11. In den ersten Studien wurden humane oder Maus-iPSCs und iNSCs aus Fibroblasten aus Hautbiopsien gewonnen, was ein invasives Verfahrenist 14,15. In diesem Zusammenhang sind PBMNCs eine ansprechende Starterzellquelle aufgrund des weniger invasiven Probenahmeprozesses und der Leichtigkeit, eine große Anzahl von Zellen innerhalb einer kurzen Expansionszeit zu erhalten16. Erste Reprogrammierungsstudien verwendeten integrative Abgabesysteme, wie z. B. lentivirale oder retrovirale Vektoren, die in vielen Zelltypen effizient und einfach umzusetzen sind17; diese Abgabesysteme können jedoch Mutationen und Reaktivierung endenvon Resttransgenen, die Sicherheitsprobleme für klinische therapeutische Zwecke darstellen12. Sendai-Virus (SeV) ist ein nicht-integratives RNA-Virus mit einem negativ-sinnlichen, einsträngigen Genom, das sich nicht in das Wirtsgenom integriert, sondern sich nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert und ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung bietet18 ,19. Rekombinante SeV-Vektoren sind verfügbar, die Reprogrammierungsfaktoren wie menschliche OCT3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC in ihren offenen Leserahmen enthalten. Darüber hinaus können SeV-Virusvektoren durch die Einführung temperaturempfindlicher Mutationen weiter verbessert werden, so dass sie schnell entfernt werden können, wenn die Kulturtemperatur auf 39 °C20angehoben wird. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Umprogrammieren von PBMNCs auf iNSCs mithilfe des SeV-Systems.
Viele Studien haben die Ableitung von DA-Neuronen von menschlichen ESCs oder iPSCs mit verschiedenen Methoden6,8,21berichtet. Es gibt jedoch einen Mangel an Protokollen, die die Differenzierung von DA-Neuronen von iNSCs im Detail beschreiben. In diesem Protokoll beschreiben wir die effiziente Generierung von DA-Neuronen von iNSCs mit einer zweistufigen Methode. Die da neuronalen Vorläufer können zur Sicherheit und Wirksamkeit in das Striatum von PD-Mausmodellen transplantiert werden. Dieser Artikel wird ein detailliertes Protokoll vorstellen, das verschiedene Stadien von der Generierung induzierter neuronaler Stammzellen durch Sendai-Virus, der Differenzierung von iNSCs in DA-Neuronen, der Etablierung von Maus-PD-Modellen bis hin zur Transplantation von DA-Vorläufern in das Striatum abdeckt. der PD-Modelle. Mit diesem Protokoll kann man iNSCs von Patienten und gesunden Spendern generieren und DA-Neuronen ableiten, die sicher, standardisierbar, skalierbar und homogen für Zelltransplantationszwecke sind, oder zur Modellierung von PD in einer Schale und zur Untersuchung der Mechanismen Grunderkrankungsbeginn und -entwicklung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentierten wir ein Protokoll, das verschiedene Stadien der iNSC-DA-Zelltherapie für PD-Modelle abdeckte. Zu den kritischen Aspekten dieses Protokolls gehören: (1) Isolierung und Erweiterung von PBMNCs und Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs durch SeV-Infektion, (2) Differenzierung von iNSCs zu DA-Neuronen, (3) Etablierung einseitiger 6-OHDA-verleumderter PD-Mausmodelle und Verhaltens- und (4) Zelltransplantation von DA-Vorstufen und Verhaltensbeurteilung.
In diesem Protokoll umfass…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Municipal Beijing Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Support Project of High-Level Teachers in Beijing Municipal Universities in the period of 13th Five-year Plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Municipal Health Commission Fund (PXM 2018_026283_000002), Beijing One Hundred, Thousand, and Ten Thousand Talents Fund (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706) Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).
Materials
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson’s disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson’s disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson’s disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
