Поколение индуцированных нейронных стволовых клеток из периферических моноядерных клеток и дифференциация к дофаминергическим нейронным прекурсорам для трансплантационных исследований
Summary
Протокол представляет перепрограммирование периферических моноядерных клеток крови, чтобы вызвать нервные стволовые клетки путем инфекции вируса Сендай, дифференциация iNSCs в дофаминергические нейроны, трансплантация прекурсоров DA в одностороннем-пораженных Болезнь Паркинсона мыши модели, и оценка безопасности и эффективности iNSC полученных dA предшественников для лечения PD.
Abstract
Болезнь Паркинсона (PD) вызвана дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов на substantia nigra pars compacta (SNpc) в брюшной мезенцефалон (VM). Клеточная заместительная терапия имеет большие перспективы для лечения PD. В последнее время, индуцированных нервных стволовых клеток (iNSCs) стали потенциальным кандидатом на клеточной заместительной терапии из-за снижения риска образования опухоли и пластичности, чтобы привести к региона конкретных нейронов и глии. iNSCs могут быть перепрограммированы из аутологических соматических клеточных источников, таких как фибробласты, периферийные моноядерные клетки крови (ПБМНК) и различные другие типы клеток. По сравнению с другими типами соматических клеток, PBMNCs являются привлекательным типом стартерных клеток из-за легкости доступа и расширения в культуре. Сендай вирус (SeV), РНК неинтегративного вируса, кодирование факторов перепрограммирования, включая человека OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC, имеет отрицательный смысл, одноцепочечный, несегментированный геном, который не интегрируется в геном хозяина, но только реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, предлагая эффективный и безопасный инструмент для перепрограммирования. В этом исследовании мы описываем протокол, в котором iNSCs получают путем перепрограммирования PBMNCs, и дифференцированы в специализированные нейроны VM DA двухступенчатым методом. Затем прекурсоры DA пересаживаются в одностороннем порядке 6-hyroxydopamine (6-OHDA) -пораженные модели мыши PD для оценки безопасности и эффективности для лечения PD. Этот метод предоставляет платформу для изучения функций и терапевтических эффектов пациентов конкретных DA нейронных клеток in vitro и in vivo.
Introduction
Болезнь Паркинсона (PD) является распространенным нейродегенеративным расстройством, вызванным дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов на substantia nigra pars compacta (SNpc) в вентральном мезенефалионе (VM), с преобладанием более 1% у населения старше 60 лет 1 , 2. За последнее десятилетие, клеточная терапия, направленная либо на замену дегенеративных или поврежденных клеток, или питание микросреды вокруг вырождающихся нейронов, показал потенциал в лечении PD3. Между тем, технология перепрограммирования добилась значительного прогресса4, который обеспечивает перспективный клеточный источник для заместительной терапии. Было доказано, что индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и эмбриональные стволовые клетки (ESCs) способны дифференцироваться в нервные клетки DA, которые могут выживать, maturate и улучшать двигательные функции при привитом крысиных и нечеловеческих моделей PD ,6,7,8. iPSCs представляют собой веху в клеточных технологиях перепрограммирования и имеют большой потенциал в трансплантации клеток; однако, все еще забота о риске образования тумора от неполно дифференцированных клеток. Альтернативным клеточным источником для трансплантации клеток является линия- совершенных взрослых стволовых клеток, полученных путем прямого перепрограммирования, таких как индуцированные нервные стволовые клетки (iNSCs), которые могут быть получены из нестабильных промежуточных, в обход плюрипотентности этап9,10,11.
Как iPSCs, так и iNSCs могут быть перепрограммированы из аутологичных клеточных источников, таких как фибробласты, периферийные моноядерные клетки крови (ПБМНК) и различные другие типы клеток12,13,14, тем самым уменьшая иммуногенности пересаженных клеток в значительной степени. Кроме того, по сравнению с iPSCs, iNSCs присущи снижение риска образования опухоли и линии, совершенные пластичности, только в состоянии дифференцировать в нейроны и глия11. В первоначальных исследованиях, человека или мыши iPSCs и iNSCs были созданы из фибробластов, полученных из биопсии кожи, которая является инвазивной процедурой14,15. С этим уважением, PBMNCs являются привлекательным источником стартер ячейки из-за менее инвазивного процесса отбора проб, и легкость для получения большого количества клеток в течение короткого периода времени расширения16. Первоначальные исследования перепрограммирования использовали интегративные системы доставки, такие как лентивирусные или ретровирусные векторы, которые являются эффективными и простыми в реализации во многих типах клеток17; однако, эти системы доставки могут вызвать мутации и реактивацию остаточных трансгенов, которые представляют проблемы безопасности для клинических терапевтических целей12. Вирус Сендай (SeV) является неинтегративным РНК-вирус омовением с отрицательным смыслом, одноцепочечным геномом, который не интегрируется в геном хозяина, а только размножается в цитоплазме инфицированных клеток, предлагая эффективный и безопасный инструмент для перепрограммирования18 ,19. Рекомбинантные векторы SeV доступны, которые содержат факторы перепрограммирования, включая человека OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC в их открытых кадрах чтения. Кроме того, seV вирусные векторы могут быть дополнительно улучшены путем введения чувствительных к температуре мутаций, так что они могут быть быстро удалены, когда температура культуры поднимается до 39 градусов по Цельсию20. В этой статье мы описываем протокол перепрограммирования PBMNCs на iNSCs с помощью системы SeV.
Многие исследования сообщили вывод dA нейронов от человека ESCs илиiPSCs с использованием различных методов 6,8,21. Тем не менее, существует нехватка протоколов, описывающих дифференциацию нейронов DA от iNSCs в деталях. В этом протоколе мы опишите эффективное генерирующее нейроны DA из iNSCs с помощью двухэтапного метода. Предшественники нейронов DA могут быть пересажены в стриатум моделей PD мыши для оценки безопасности и эффективности. В этой статье будет представлен подробный протокол, который охватывает различные этапы от генерации индуцированных нервных стволовых клеток вирусом Сендай, дифференциация iNSCs в DA нейронов, создание мыши PD модели, для трансплантации прекурсоров DA в стриатума моделей PD. Используя этот протокол, можно генерировать iNSCs от пациентов и здоровых доноров и получить DA нейронов, которые являются безопасными, стандартизируемыми, масштабируемыми и однородными для клеточной трансплантации целей, или для моделирования PD в тарелке и исследования механизмов основного заболевания и развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представили протокол, который охватывает различные этапы iNSC-DA клеточной терапии для моделей PD. Критические аспекты этого протокола включают: (1) изоляция и расширение ПБМНК и перепрограммирование ПБМНК в iNSCs с помощью инфекции SeV, (2) дифференциация iNSCs для нейронов DA, (3) создание ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана следующими грантами: Проект стволовых клеток и переводов (2016YFA0101403), Национальный фонд естественных наук Китая (81661130160, 81422014, 81561138004), Пекинский муниципальный фонд естественных наук (5142005), Пекин таланты Фонда (20170000212223TD03), Поддержка проекта высокого уровня учителей в Пекинских муниципальных университетов в период 13-й пятилетний план (CIT и TCD20180333), Пекинская медицинская система высокого уровня талант премии (2015-3-063), Пекин Муниципальный фонд Комиссии по здравоохранению (PXM 2018-026283-000002), Пекин Сто, тысяча и десять тысяч талантов фонда (2018A03), Пекинское муниципальное управление больниц клинической медицины Развития специальной финансовой поддержки (YLX201706), и Королевское общество-Ньютон Расширенный стипендий (NA150482).
Materials
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson’s disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson’s disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson’s disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
