Generering av indusert nevrale stamceller fra perifere mononukleære celler og differensiering mot Dopaminerg Nevron forløpere for transplantasjon Studies

Summary

Protokollen presenterer omprogrammering av perifere blod mononukleære celler for å indusere nevrale stamceller ved Sendai virus infeksjon, differensiering av iNSCs inn dopaminerg neurons, transplantasjon av DA forløpere til ensidig-lesioned Musemodeller for Parkinsons sykdom, og evaluering av sikkerhet og effekt av iNSC-avledede DA forløpere for PD-behandling.

Abstract

Parkinsons sykdom (PD) er forårsaket av degenerasjon av dopaminerg (DA) neurons på substantia Nigra Pars compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM). Celle erstatning terapi har store løftet for behandling av PD. nylig induserte nevrale stamceller (iNSCs) har dukket opp som en potensiell kandidat for celle erstatning terapi på grunn av redusert risiko for tumor dannelse og plastisitet å gi opphav til områdespesifikke neurons og glia. iNSCs kan omprogrammeres fra autologous somatiske Cellular kilder, som fibroblaster, perifert blod mononukleære celler (PBMNCs) og forskjellige annet typer av celler. Sammenlignet med andre typer somatiske celler, PBMNCs er en tiltalende Start celle type på grunn av det enkle å få tilgang til og utvide i kultur. Sendai virus (SeV), en RNA ikke-integrerende virus, koding omprogrammering faktorer, inkludert humant OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-myC, har en negativ-Sense, Single-strandet, ikke-segmentert Genova som ikke integreres i vert Genova, men bare replikerer i cytoplasma av infiserte celler, og tilbyr en effektiv og trygg bil for omprogrammering. I denne studien, beskriver vi en protokoll der iNSCs er innhentet av omprogrammering PBMNCs, og differensiert i spesialiserte VM DA neurons av en to-trinns metode. Da prekursorer er transplantert inn ensidig 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mus modeller for å evaluere sikkerhet og effekt for behandling av PD. Denne metoden gir en plattform for å undersøke funksjoner og terapeutiske effekter av pasientspesifikke DA nevrale celler in vitro og in vivo.

Introduction

Parkinsons sykdom (PD) er en vanlig nevrodegenerative lidelse, forårsaket av degenerasjon av dopaminerg (DA) neurons ved substantia Nigra Pars compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM), med en prevalens på mer enn 1% i befolkning over 60 år ¹ den andre ^{, 2}. i løpet av det siste tiåret, celle terapi, som tar sikte på enten å erstatte den degenerative eller skadede celler, eller nærende mikromiljøet rundt degenereres neurons, har vist potensial i behandling av PD³. I mellomtiden har omprogrammering teknologi gjort betydelige fremskritt⁴, som gir en lovende mobil kilde for erstatning terapi. Human indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) og embryonale stamceller (ESCs) har vist seg å være i stand til å differensiere i DA nevrale celler, som kunne overleve, maturate, og forbedre motoriske funksjoner når podet inn rotte og ikke-menneskelige primater PD modeller^{5 ,6,7,8}. iPSCs representerer en milepæl i cellulære omprogrammering teknologier og har et stort potensial i celle transplantasjon; Det er imidlertid fortsatt en bekymring for risikoen for tumor dannelse fra ufullstendig differensiert celler. En alternativ mobil kilde for celle transplantasjon er avstamning-begått voksen stamceller innhentet gjennom direkte omprogrammering, slik som indusert nevrale stamceller (iNSCs), som kan utledes fra den ustabile mellom produkter, omgåelsen pluripotency trinn^9,10,11.

Både iPSCs og iNSCs kan være omprogrammeres fra autologous cellulære kilder, for eksempel fibroblaster, perifert blod mononukleære celler (PBMNCs) og ulike andre typer celler^12,13,14, og dermed redusere immunogenisitet av transplanterte celler i stor grad. Videre, sammenlignet med iPSCs, iNSCs er iboende med redusert risiko for tumor dannelse og avstamning-begått plastisitet, bare i stand til å differensiere til neurons og glia¹¹. I den innledende studier, menneskelig eller mus iPSCs og iNSCs ble generert fra fibroblaster innhentet fra huden biopsier, som er en invasiv prosedyre^14,15. Med denne respekten, PBMNCs er en tiltalende for rett celle kilde på grunn av mindre invasiv prøvetaking prosessen, og enkelt å få et stort antall celler innen en kort periode med utvidelse tid¹⁶. Initial omprogrammering studier ansatt integrerende levering systemer, for eksempel lentiviral eller retroviral vektorer, som er effektiv og enkel å implementere i mange typer celler¹⁷; disse leveringssystemene kan imidlertid forårsake mutasjoner og reaktivering av gjenværende transgenes, som utgjør sikkerhetsproblemer for kliniske terapeutiske formål¹². Sendai virus (SeV) er en ikke-integrerende RNA virus med en negativ-Sense, Single-strandet Genova som ikke integreres ikke i verten Genova, men bare replikerer i cytoplasma av infiserte celler, og tilbyr en effektiv og trygg bil for omprogrammering^{18 ,19}. Rekombinant SeV vektorer er tilgjengelige som inneholder omprogrammering faktorer, inkludert menneskelige OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-myC i sine åpne Reading rammer. I tillegg kan SeV viral vektorer bli ytterligere forbedret ved å innføre temperaturfølsomme mutasjoner, slik at de kunne bli raskt fjernet når kulturen temperaturen er hevet til 39 ° c²⁰. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å programmere PBMNCs til iNSCs ved hjelp av SeV-systemet.

Mange studier har rapportert avledning av da neurons fra humant ESCs eller iPSCs ved hjelp av ulike metoder^6,8,21. Det er imidlertid en mangel på protokoller som beskriver differensiering av DA neurons fra iNSCs i detaljer. I denne protokollen vil vi beskrive den effektive generasjonen av DA neurons fra iNSCs ved hjelp av en to-trinns metode. DA neuronal prekursorer kan bli transplantert inn i striatum av PD mus modeller for sikkerhet og effekt evalueringer. Denne artikkelen vil presentere en detaljert protokoll som dekker ulike stadier fra generering av indusert nevrale stamceller ved Sendai virus, differensiering av iNSCs i DA neurons, etablering av mus PD modeller, til transplantasjon av DA forløpere i striatum av PD-modellene. Ved hjelp av denne protokollen, kan man generere iNSCs fra pasienter og sunne donorer og utlede DA neurons som er trygge, standardizable, skalerbar og homogen for celle transplantasjon formål, eller for modellering PD i en tallerken og etterforskning av mekanismene underliggende sykdomsutbruddet og utviklingen.

Protocol

Alle prosedyrer må følge retningslinjene for institusjonell menneskelig forskning etikk komiteen. Informert samtykke må innhentes fra pasienter eller friske frivillige før blodoppsamling. Denne protokollen ble godkjent av institusjonens menneskelige forskning etikk komiteen og ble utført i henhold til institusjonens retningslinjer for omsorg og bruk av dyr. 1. innsamling, isolering og utvidelse av PBMNCs Innsamling av PBMNCs Samle 10-20 mL av donor per…

Representative Results

Her rapporterer vi en protokoll som dekker ulike stadier av iNSC-DA celle terapi for å behandle PD-modeller. For det første ble PBMNCs isolert og utvidet, og omprogrammeres inn iNSCs av SeV infeksjon. En skjematisk fremstilling av prosedyrene med PBMNC ekspansjon og iNSC induksjon er vist i figur 1. På dag-14, PBMNCs ble isolert ved hjelp av en tetthet gradient medium (tabell av materialer). Før sentrifugering ble blodet fortynnet med PBS og graderings mediet med tetthet…

Discussion

Her har vi presentert en protokoll som dekket ulike stadier av iNSC-DA celle terapi for PD-modeller. Kritiske aspekter ved denne protokollen inkluderer: (1) isolering og utvidelse av PBMNCs og omprogrammering av PBMNCs i iNSCs av SeV infeksjon, (2) differensiering av iNSCs til DA neurons, (3) etablering av ensidig 6-OHDA-lesioned PD mus modeller og atferdsmessige vurdering, og (4) celle transplantasjon av DA forløpere og atferdsdata vurdering.

I denne protokollen involverer den første delen …

Materials

15-ml conical tube	Corning	430052
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate	Corning	3337
50-ml conical tube	Corning	430828
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381
6-well plate	Corning	3516
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Cell dissociation reagent
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A92902	Toxic with skin contact
B27 supplement	Invitrogen	17504044
BDNF	Peprotech	450-02	Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin	BD	367871
BSA	yisheng	36106es60	Fetal bovine serum
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2	ZENOAQ	100ml	Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate	Invitrogen	11905031
CHIR99021	Gene Operation	04-0004
Coverslip	Fisher	25*25-2
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417-10mg
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
DMEM-F12	Gibco	11330
DMEM-F12	Gibco	11320
Donkey serum	Jackson	017-000-121
EPO	Peprotech	100-64-50UG	Human Erythropoietin
FGF8b	Peprotech	100-25
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	P=1.077, density gradient medium
GDNF	Peprotech	450-10	Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12	Gibco	11765-054
HBSS	Invitrogen	14175079	Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor	Millpore	LIF1010
Human recombinant SCF	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Human insulin-like growth factor
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	Human interleukin 3
IMDM	Gibco	215056-023	Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	51500-056	Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement	Gibco	10828028	Serum free basal medium
Laminin	Roche	11243217001
Microsyringe	Hamilton	7653-01
N2 supplement	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Non-essential amino acid
Neurobasal	Gibco	10888	Basic medium
PDL	Sigma-Aldrich	P7280	Poly-D-lysine
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Gene Operation	04-0010-10mg	Store from light at -20℃
Sendai virus	Life Technologies	MAN0009378
Sucrose	baiaoshengke
TGFβⅢ	Peprotech	100-36E	Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin	R&D Systems	2914-HT-100G
Triton X 100	baiaoshengke		Nonionic surfactant
Trypan blue	Gibco	T10282
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126