Summary
Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.
Abstract
Es gibt viel über den Beginn und das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen zu verstehen, einschließlich der zugrunde liegenden Gene, die dafür verantwortlich sind. Das Forward-Genscreening mit chemischen Mutagenen ist eine nützliche Strategie für die Kartierung mutierter Phänotypen zu Genen zwischen Drosophila und anderen Modellorganismen, die konservierte Zellwege mit Menschen teilen. Wenn das mutierte Gen von Interesse in frühen Entwicklungsstadien von Fliegen nicht tödlich ist, kann ein Klettertest durchgeführt werden, um auf phänotypische Indikatoren für eine verminderte Gehirnfunktion, wie niedrige Kletterraten, zu überprüfen. Anschließend kann eine sekundäre histologische Analyse des Hirngewebes durchgeführt werden, um die neuroprotektive Funktion des Gens durch Bewertung von Phänendern der Neurodegeneration zu überprüfen. Gen-Mapping-Strategien umfassen meiotische und Mangel-Mapping, die auf diesen gleichen Assays verlassen können durch DNA-Sequenzierung gefolgt werden, um mögliche Nukleotid-Änderungen im Gen von Interesse zu identifizieren.
Introduction
Neuronen sind zum größten Teil post-mitotisch und unfähig,1,2zu teilen. Bei den meisten Tieren gibt es neuroprotektive Mechanismen, um diese Zellen während der gesamten Lebensdauer des Organismus zu erhalten, besonders im Alter, wenn Neuronen am anfälligsten für Schäden sind. Gene, die diesen Mechanismen zugrunde liegen, können bei Mutanten identifiziert werden, die Neurodegeneration aufweisen, einem phänotyptischen Indikator für den Verlust des Neuroprotektions, mit einem vorwärts genetischen Protokoll. Vorwärtsgenetische Siebe, die chemische Mutagene wie Ethylmethansulfonat (EMS) oder N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) verwenden, sind aufgrund der zufälligen Punktmutationen, die sie induzieren, besonders nützlich, was zu einem von Natur aus unvoreingenommenen Ansatz führt, der Licht auf zahlreiche Genfunktionen in eukaryotischen Modellorganismen3,4,5 (im Gegensatz dazu erzeugt die Röntgenmutagenese DNA-Brüche und kann zu Einer Neuanordnung anstelle von Punktmutationen führen6).
Die gemeine Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein ideales Thema für diese Bildschirme aufgrund ihrer hohen Qualität, gut benoteten Genomsequenz, ihrer langen Geschichte als Modellorganismus mit hochentwickelten genetischen Werkzeugen und vor allem ihrer gemeinsamen Evolutionsgeschichte mit Menschen7,8. Ein begrenzender Faktor für die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist die frühe Letalität, die durch die mutierten Gene verursacht wird, was Tests im Altervon 9Jahren verhindern würde. Bei nicht-tödlichen Mutationen ist jedoch ein Klettertest, der negative Geotaxis ausnutzt, eine einfache, wenn auch umfangreiche Methode zur Quantifizierung beeinträchtigter motorischer Funktionsfähigkeit10. Um eine ausreichende bewegungsmotorische Reaktivität zu zeigen, sind Fliegen auf neuronale Funktionen angewiesen, um die Richtung zu bestimmen, ihre Position zu spüren und die Bewegung zu koordinieren. Die Unfähigkeit von Fliegen, als Reaktion auf Reize ausreichend zu klettern, kann daher auf neurologische Defektehinweisen 11. Sobald ein bestimmter defekter Kletterphänotyp identifiziert ist, können weitere Tests mit einem sekundären Bildschirm wie der histologischen Analyse von Hirngewebe verwendet werden, um Neurodegeneration in kletterdefekten Fliegen zu identifizieren. Nachfolgende Genkartierung kann dann verwendet werden, um die genomische Region auf dem Chromosom zu enthüllen, das das defekte neuroprotektive Gen von Interesse trägt. Um den chromosomalen Bereich von Interesse einzugrenzen, kann eine meiotische Kartierung mit mutierten Fliegenlinien durchgeführt werden, die dominante Markergene mit bekannten Positionen auf dem Chromosom tragen. Die Markergene dienen als Bezugspunkt für die Mutation, da die Häufigkeit der Rekombination zwischen zwei Loci eine messbare Entfernung bietet, die verwendet werden kann, um die ungefähre Position eines Gens abzubilden. Schließlich erzeugt das Überschreiten der mutierten Linien mit Linien mit ausgewogenen Mängeln auf dem meiotisch kartierten chromosomalen Bereich von Interesse einen Komplementierungstest, bei dem das Gen von Interesse überprüft werden kann, wenn sein bekannter Phänotyp5exprimiert wird. Polymorphe Nukleotidsequenzen im identifizierten Gen, die möglicherweise zu veränderten Aminosäuresequenzen führen, können durch Sequenzierung des Gens und Vergleich mit der Drosophila-Genomsequenz ausgewertet werden. Die anschließende Charakterisierung des gens von Interesse kann das Testen zusätzlicher mutierter Allele, Mutationsrettungsexperimente und die Untersuchung zusätzlicher Phänotypen umfassen.
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Protocol
1. Vorbereitung und Alterung von Fliegen
- Erhalten oder generieren6 eine Sammlung von Drosophila Mutanten, die für den genetischen Bildschirm verwendet werden. Hier werden ENU-mutagenisierte Linien verwendet, die dem zweiten Chromosom zugeordnet und über CyO ausgeglichen sind.
- Verstärken Sie experimentelle Genotyplinien in einem Inkubator, der bei 25 °C, 12 h Hell-/Dunkel-Zyklus auf Maismehl-Melasse-Medium eingestellt ist.
- Sammeln Sie etwa 20 homozygote Nachkommen zwischen 0-2 Tagen der Erwachsenen-Eclosion von jedem experimentellen Genotyp. Beseitigen Sie geschlechtsspezifische Voreingenommenheit, indem Sie konsequent entweder männliche oder weibliche Fliegen sammeln.
- Altern Sie die Fliegen auf Maismehl-Melasse Medium wie gewünscht bei 29 °C, Kippen Sie die Fläschchen alle 2-3 Tage, um die Fliegen auf frische Nahrung zu halten, wie sie älter werden. Auf dem hier vorgestellten Bildschirm waren die Fliegen 10-12 Tage alt.
- Montieren Sie eine Kletter-Assay-Testkammer mit zwei Fläschchen und Klebeband, wie zuvor beschrieben10. Die Fläschchen sollten an beiden offenen Enden angeschlossen werden. Verwenden Sie ein Lineal, um eine 5 cm Linie an einem Ende der Kammer zu markieren.
2. Protokoll 1: Klettertest (angepasst von Ali et al.10)
- Bestätigen Sie den Klettertest. Testen Sie in dieser Studie den Klettertest auf der Grundlage der zuvor beschriebenen Methodik von Ali et al.10, mit ElavC155>UAS-TauR406W (mit niedrigeren Kletterpassraten) und ElavC155>UAS-GFP ( Steuerung) und ElavC155>UAS-mCherry (Steuerung) fliegt.
- Drehen Sie die Fliegen in eine Prüfkammer, eine Linie nach der anderen (verwenden Sie keine CO2-Anästhesie) und lassen Sie sie für 5 min erholen. Wenn tests an verschiedenen Tagen durchgeführt wird, führen Sie den Test zur gleichen Zeit des Tages durch. In dieser Studie wurden alle Klettertests am Nachmittag durchgeführt, um die zirkadianen Auswirkungen auf die Fortbewegung zu kontrollieren12.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Fliegen beim Testen direkter Sonneneinstrahlung auszusetzen; dies wird ihre Fähigkeit zu klettern stören. - Tippen Sie die Kammer (markiert seitlich nach unten) zwangsweise auf ein Mauspad, das 3 mal auf einer festen Oberfläche platziert wird, sodass alle Fliegen den Test unten beginnen. Beobachten Sie die Flugfortbewegung über einen Zeitraum von 10 s.
- Zeichnen Sie die Anzahl der Fliegen auf, die die 5 cm Linie innerhalb dieser Zeit erreichen oder passieren, sowie die Gesamtzahl der getesteten Fliegen. Wiederholen Sie das Protokoll, warten Sie 1 min zwischen jeder Testversion, für mindestens 3 Testreplikationen pro Zeile.
HINWEIS: In der vorliegenden Studie enthielt jede Durchstechflasche zwischen 2 und 19 Fliegen für das Erstscreening (männliche Fliegen) und zwischen 6 und 21 Fliegen für die mutierte Mangelanalyse von gekreuzten weiblichen Linien (Abschnitt 5.3.).
3. Protokoll 2: Auswahl von Drosophila-Stämmen zur weiteren Analyse
- Geben Sie die Kletter-Assay-Daten in Microsoft Excel oder ähnliche Software ein und berechnen Sie die Kletterpassrate für jede Linie über alle Replikationen als Prozentsatz.
-
Führen Sie statistische Analysen durch, um mutierte Linien zu erkennen, die erheblich vom durchschnittlichen Anstiegsprozentwert aller Linien abweichen, indem Sie das R-Softwarepaket13verwenden.
- Lesen Sie Datendateien ein, die für R kuratiert wurden (.csv- oder .txt-Dateien mit einer Spalte für jede Variable oder jeden Faktor und Zeilen, die die spezifischen Werte darstellen).
HINWEIS: Hier wurden Daten für Männchen (Anfangstest) und Weibchen (Linie 867 gekreuzt zu Mangellinien) in separate .xlsx-Blätter als zwei Spalten eingegeben, eine, in der die Zeilen der Spalte die mutierte Linie identifizieren und wie oft der Assay repliziert wurde und das andere, in dem Zeilen stellen den durchschnittlichen Klettererfolg (in Prozent) für jede Replizionfläschchen von Fliegen dar. - Lesen Sie die Daten mit dem folgenden Code in R:
mali<-read.csv(".. /male_init.csv")
femdef<-read.csv(".. /fem_def_cross.csv")
HINWEIS: Die ".." in den Pfadverzeichnissen sind absolute Pfade aus dem Stammverzeichnis des Computers des Benutzers und müssten vom einzelnen Benutzer für die Verzeichnispfade seines Computers angegeben werden. - Lineare Modellierung durchführen
- Führen Sie die Dummy-Variablenregression mit der lm-Funktion in R durch. Bewerten Sie für die erste Analyse mutierter Linien die Bedeutung von Faktorpegeleffekten (MutantLinien) auf prozentualen Anstiegserfolg gegenüber dem großen Mittelwert für eine durchschnittliche zentrierte Antwortvariable Null (Prozenterfolg).
HINWEIS: Die "-1" am Ende des lm-Funktionsaufrufs in Abschnitt 3.2.3.2. entfernt das Intercept und ermöglicht es uns, alle Faktorstufen mit dem mittleren Mittelwert von Prozent des Kletterdurchgangs zu testen. - Drucken Sie die Ergebnisse mit der R-Zusammenfassungsfunktion auf den Bildschirm:
mali_anova<-lm(scale(mali-P_Success)-Mali-Mutant_line -1)
Zusammenfassung(mali_anova) - Verwenden Sie Steuerlinien (falls vorhanden) als Basis, um Faktorleveleffekte gegen die Verwendung des folgenden R-Codes zu testen: x<-relevel(femdef-Mutant_line, ref="a867_plus")
femdef_anova<-lm(femdef-P_success-x)
Zusammenfassung(femdef_anova)
HINWEIS: Die erste Codezeile ordnet die Faktorebenen so neu an, dass die negative Steuerlinie zum Basislinienabfang wird, auf den alle anderen Faktorebenen (Mutantlinien) mit den integrierten t-Tests in der lm-Funktion getestet werden.
- Führen Sie die Dummy-Variablenregression mit der lm-Funktion in R durch. Bewerten Sie für die erste Analyse mutierter Linien die Bedeutung von Faktorpegeleffekten (MutantLinien) auf prozentualen Anstiegserfolg gegenüber dem großen Mittelwert für eine durchschnittliche zentrierte Antwortvariable Null (Prozenterfolg).
- Lesen Sie Datendateien ein, die für R kuratiert wurden (.csv- oder .txt-Dateien mit einer Spalte für jede Variable oder jeden Faktor und Zeilen, die die spezifischen Werte darstellen).
- Wählen Sie je nach Alter zum Zeitpunkt der Prüfung einen Schwellenwert für Kandidatenlinien aus. Um den Schwellenwert zu bestimmen, führen Sie einen Vorläufigen Test im gewünschten Alter mit bekannten Mutanten durch, die Neurodegeneration und niedrige Kletterpassraten im Vergleich zum Wildtyp aufweisen, Kontrollfliegen10.
HINWEIS: Eine Durchgangsrate unter 50% kann für 10 Tage alte Fliegen geeignet sein, wie zuvor für Drosophila-Linien berichtet, die das menschliche Neurodegeneration-bezogene Gen Tau im Nervensystem überausdrücken10. Ältere Fliegen sollten eine höhere Passing-Rate-Schwelle haben, da sie voraussichtlich eine verminderte Fortbewegung aufweisen, also eine erhöhte Neurodegeneration.
4. Protokoll 3: Histologieanalyse
- Tragen Sie Handschuhe, trennen Sie fliegende Köpfe mit einer chirurgischen Klinge nach dem Klettertest und verwenden Sie einen Pinsel, um sie sanft in 1 ml Carnoys Fixativ (6:3:1 von 100% EtOH: Chloroform: Eisessig) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr O/N bei 4 °C zu platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Köpfe in der fixativen Lösung versinken.
- Ersetzen Sie die Fixierlösung am nächsten Tag durch 1 ml 70% EtOH und halten Sie die Proben für die zukünftige Analyse noch bei 4 °C.
HINWEIS: Das Protokoll kann bei diesem Schritt angehalten werden. - Platzieren Sie die Köpfe ab Schritt 4.2. maximal fünf pro Mikrobiopsiekassette. Legen Sie die Kassetten sofort in einen behälter gefüllt mit 70% EtOH. Lagern Sie den Behälter bei 4 °C vor dem Versand in eine Histologie-Einrichtung zur Verarbeitung und Paraffineinbettung der Köpfe. Wenn Geräte für die Gewebeverarbeitung und Einbettung verfügbar sind, folgen Sie Schritt 4.4.
- Einbetten der Köpfe in Paraffin für Mikrotome-Sektion:
- Befolgen Sie die Programmeinstellungen für eine automatisierte Gewebeverarbeitungsmaschine in der in Tabelle 1 dargestellten Reihenfolge, um die Köpfe zu dehydrieren, zu löschen und mit Paraffin zu infiltrieren.
- Übertragen Sie die Proben in Metall-Basisformen, die mit Paraffin, das bei 60 °C erhitzt wird, mit einer Paraffin-Einbettstation in die Kassette passen.
- Richten Sie die Köpfe (antero-posterior Ausrichtung nach oben) in der Basisform mit feinen Zangen, um eine korrekte Visualisierung des Gehirngewebes nach Abschnitten zu ermöglichen. Dies kann durch Aufwärmen des Paraffins bei 60 °C und ggf. Neupositionierung der Köpfe erfolgen.
HINWEIS: Metallformen können durch Einweg-Basisformen ersetzt werden. - Positionieren Sie die Kassette auf der Oberseite der entsprechenden Grundform und bewegen Sie diese vorsichtig auf die gekühlte Seite der Paraffineinbettstation (4 °C). Warten Sie, bis der Block aushärtet, bevor Sie ihn von der Station entfernen.
- Entfernen Sie den Block, indem Sie die Form sanft von der Kassette trennen.
- Schneiden Sie jeden Paraffinblock vor dem Schnitt, um die zu schneidende Oberfläche zu minimieren.
- Stellen Sie das Mikrotome so ein, dass 5 m Abschnitte jedes Blocks geschnitten werden.
- Schnitt-Paraffinband mit dem Gewebe in einem beheizten Wasserbad (35 °C) für maximal 5 min.
- Tauchen Sie einen polylysinbeschichteten Schlitten (hilft, das Gewebe zu halten) in das beheizte Wasserbad ein und platzieren Sie das geschnittene Band mit Holzapplikatoren auf der Rutsche. Lassen Sie die Dias lufttrocknen O/N bei Raumtemperatur.
- Erhitzen Sie die Dias 15 min bei 63 °C mit einem Gleitwärmer.
- Legen Sie die Dias auf eine Rutsche Färbestange und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) unter einer Dunstabzugshaube unter Beachtung der folgenden Schritte.
- Legen Sie das Rack in Histochoice (ungiftiger Ersatz von Xylol, das hilft, das Paraffin aus der Probe zu entfernen) für 5 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem mit Histochoice gefüllten Behälter für 5 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 100% EtOH 1 für 5 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 100% EtOH 2 für 5 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 95% EtOH für 3 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 70% EtOH für 3 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Mit destillierten H2O gefüllten Behälter für 5 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter mit Harris Hematoxylin für 2-5 min gefüllt.
- Nehmen Sie das Rack aus der Hematoxylin-Lösung und legen Sie es 10 min unter fließendes Leitungswasser.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter mit destilliertem Wasser gefüllt durch einen kurzen Dunk.
- Übertragen Sie das Rack in einem mit Eosin gefüllten Behälter für 1-2 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter mit 95% EtOH gefüllt, indem Sie einen kurzen Dunk.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 95% EtOH für 5 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 100% EtOH für 5 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 100% EtOH für 5 min.
- Übertragen Sie das Rack in einem mit Histochoice (oder Xylol) gefüllten Behälter für 5-10 min, bis alle Dias montiert sind.
- Montieren Sie den Schlitten und den Deckel (24 mm x 60 mm Größe). Mit Zangen nehmen Sie die Rutsche aus der Histochoice- oder Xylol-Lösung und machen Sie einen dünnen Streifen Montagemedium darauf. Legen Sie den Deckelrutsch vorsichtig auf die Oberseite, versuchen, die Bildung von Blasen zu vermeiden.
- Lassen Sie das Montagemedium auf montierten Dias O/N unter der Dunstabzugshaube härten, bevor Sie analysieren.
- Befleckte Dias in einer Box bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Quantifizieren Sie die Neurodegeneration, indem Sie alle seriellen Abschnitte auf dem Dia bei der 20-fachen Vergrößerung unter einem Lichtmikroskop betrachten. Untersuchen Sie das gesamte Gehirn, unter Berücksichtigung der qualitativen Notiz von Größe und Anzahl der Vakuolen, die in drei aufeinanderfolgenden Abschnitten erscheinen.
- Erhalten Sie Bilder von repräsentativen Gehirnabschnitten in etwa Mitte des Gehirns mit einem Lichtmikroskop, das mit Bildgebungssoftware ausgestattet ist.
5. Protokoll 4: GenMapping des rezessiven Mmutanten-Phänotyps
- Überschreiten Sie die Kandidatenlinie zu einem wilden Typ CantonS (BL_ 9517) oder einem anderen wilden Typ oder isogenisierten Stamm (z. B. OregonR (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) oder yw (BL_ 6599), um festzustellen, ob der Phänotyp dominant ist oder Rezessive.
HINWEIS: Die Ergebnisse dieses Schritts leiten die nächsten Schritte der Zuordnung. Wenn der Phänotyp rezessiv ist, kann eine Mangelzuordnung durchgeführt werden.- Mit einem Pinsel, machen Sie ein Kreuz, indem Sie in eine lebensmittelhaltige Durchstechflasche CO2-anesthetisierte Fliegen der mutierten Linie von Interesse (5 Männchen) und der CantonS Linie (10-15 Jungfrau Weibchen). Legen Sie die Durchstechflasche bei 25 °C.
- Sammeln Sie heterozygote F1 Nachkommen und wiederholen Klettern und Histologie-Experimente.
- Vergleichen Sie die erhaltenen Ergebnisse mit der Steuerlinie allein und mit den homozygoten Mutanten. Ein guter Hinweis auf rezessiven Phänotyp wird sein, wenn heterozygote Mutanten ähnliche Phänotypen wie Wildtypfliegen aufweisen.
- Führen Sie meiotische Secabisse durch, um die Position der Mutation auf dem zweiten Chromosom grob zu schätzen, indem Sie die wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (BL_3227) oder einen gleichwertigen Stamm mit assoziierten dominanten Markern an bekannten zytologische Position. In diesem Fall war bisher bekannt, dass sich die Mutation auf dem zweiten Chromosom befindet.
- Mit einem Pinsel, machen Sie ein Kreuz, indem Sie in eine lebensmittelhaltige Durchstechflasche CO2-anesthetisierte Fliegen der mutierten Linie von Interesse (5 Männchen) und die wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO Linie (10 Weibchen). Legen Sie die Durchstechflasche bei 25 °C.
HINWEIS: Das Ziel dieses Kreuzes ist es, heterozygote Weibchen zu erzeugen, die das Chromosom mit der neuen Mutation und dem Markerchromosom tragen, das sich während der Meiose6,14rekombinieren wird. Weibliche F1-Nachkommen werden anstelle von Männern gewählt, da eine Rekombination bei Männern nicht auftritt. - Sammeln Sie mindestens 15 jungfräuliche weibliche Nachkommen, die das Chromosom mit der neuen Mutation und dem Markerchromosom tragen, und kreuzen Sie sie auf 5 Männchen aus einer ausgewogenen Linie, die einen anderen sichtbaren dominanten Marker trägt (z. B. CyO/snaSco (BL_2555) oder Äquivalent).
- Sammeln Sie heterozygote männliche Nachkommen, die entweder Sco oder CyO und das potenziell rekombinierte Chromosom aus dem Kreuz in Schritt 5.2.2 tragen. und paaren sie einzeln mit jungfräulichen Weibchen aus dem Bestand, der das mutierte Chromosom trägt.
- Sammeln Sie die Nachkommen aus dem letzten Kreuz in Schritt 5.2.3 beschrieben. und Alter der Fliegen bei 29 °C (in dieser Studie waren fliegen 10-14 Tage alt).
- Sammeln Sie Köpfe, führen Sie eine Histologieanalyse durch, wie in Protokoll 3 beschrieben, und betrachten Sie die Dias mit Hirnabschnitten, um den Grad der Neuropathologie zu bestimmen, wie in Schritt 4.11 beschrieben. Die Histologieanalyse wird anstelle von Fortbewegungsanalysen aufgrund von Phänotypen durchgeführt, die den Klettertest beeinflussen können, wie Zwiespalt (J), der Flüssigkeitsansammlung in den Flügelnverursacht 15.
- Mit einem Pinsel, machen Sie ein Kreuz, indem Sie in eine lebensmittelhaltige Durchstechflasche CO2-anesthetisierte Fliegen der mutierten Linie von Interesse (5 Männchen) und die wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO Linie (10 Weibchen). Legen Sie die Durchstechflasche bei 25 °C.
- Führen Sie die Mangelzuordnung auf dem verengten Bereich des Chromosoms durch, um die Position der rezessiven Mutation mit dem Klettertest zu verfeinern. Jede Mangellinie hat eine Deletion verschiedener Regionen der Chromosomen, so dass sie für Komplementierungstests verwendet werden können.
- Beginnen Sie mit großen Mängeln, die sich über die in der meiotischen Kartierung identifizierte Region erstrecken, die dann durch die Verwendung kleinerer Mängel weiter eingegrenzt werden können. Wenn die Mangelanalyse zu mehr als einem Kandidatengen führt, wird die Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi)-Beständen empfohlen, um sie anzuvisieren.
- Kreuzlinien aus dem Drosophila-Mangelkit 16 für das zweite Chromosom (DK2L in dieser Studie) und suchen nach einer Nichtkomplementierung des Phänotyps des Interesses (in dieser Studie: Kletterpassrate von 8,5%, die der Passrate von homozygote Fliegen von Linie 867 als Positivkontrolle verwendet).
- Bestätigen Sie den Neurodegeneration-Phänotyp mit Hilfe der histologischen Verifikation, wie in Abschnitt 4 (Protokoll 3) beschrieben.
6. Protokoll 5: DNA-Sequenzierung und -Analyse
HINWEIS: Denken Sie daran, dass enU mutagenese Punktmutationen11einführt.
- Entwerfen Sie Vorwärts- und Reverse-Primer-Sequenzen, die den Exon-Kodierungsbereich des Bratgens zur Amplifikation durch Polymerase Chain Reaction (PCR) des Interessenbereichs flankieren (bei Zeile 867 wird ein DNA-Fragment der Größe 3.247 bp für Sequenzierung17).
-
Extrahieren Sie DNA aus einer einzigen Fliege18 :
- Die Fliege vorsichtig in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 50 l Squishing-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl und 200 g/ml Proteinase K; das Enzym muss vor jeder Verwendung frisch aus einem gefrorenen Vorrat verdünnt werden) mit einem P100- oder P200-Rohrkipper.
- Inkubieren für 30 min bei 37 °C
- Deaktivieren Sie die Proteinase K, indem Sie das Rohr für 2 min bei 95 °C platzieren.
HINWEIS: Die extrahierte DNA kann bei 4 °C für mehrere Monate gespeichert werden.
- Führen Sie die PCR-Reaktion mit einer Hochtreue-DNA-Taq-Polymerase (Reagenzien und thermische Kreislaufbedingungen, die in dieser Studie verwendet werden, sind in Tabelle 2 bzw. Tabelle3) unter Beachtung der Anweisungen des Herstellers dargestellt und führen Sie das PCR-Produkt auf einer 1 % Agarose-Gel enthält Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, eine ungiftige Alternative von Ethidiumbromid.
- Verwenden Sie das Band der richtigen Größe aus dem Gel mit einem Skalpell und reinigen Sie das PCR-Produkt mit dem Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System (Promega) oder einem gleichwertigen Kit, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
- Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, die für die DNA-Sequenzierung verwendet werden, um möglichst den gesamten Interessenbereich abzudecken. Sequenzieren Sie die gelgereinigte DNA aus dem vorherigen Schritt, um Punktmutationen zu identifizieren. Eine hohe Genauigkeit in der automatisierten Fluoreszenz-Sanger-Sequenzierung konnte für bis zu 700 bp erreicht werden.
HINWEIS: Die Ex Taq Polymerase (TaKaRa) kann verwendet werden, um PCR-Produkte aus genomischen DNA-Vorlagen bis zu 20 kb Größe zu verstärken. -
Analysieren Sie erhaltene DNA-Sequenzen mit dem A-Plasmid-Editor (ApE, von M. Wayne Davis) oder einer ähnlichen Software, indem Sie sie ausrichten und mit den Sequenzen vergleichen, die nach der Sequenzierung derselben genomischen Region eines Referenzstammes (z. B. ursprünglich mutagenisiert) erhalten wurden. Linie).
- Öffnen Sie Sequenzierungsdateien mit ApE. Als Referenz verwenden Sie eine ApE-Datei, die die genomische Konsenssequenz des von Flybase heruntergeladenen Bratgens enthält, oder eine Datei, die Ergebnisse für die Sequenz der genetischen Hintergrundkontrolle enthält (z. B. ursprünglich mutagenisierte Drosophila Linie).
- Wechseln Sie zu Werkzeuge, und richten Siedann Sequenzen aus. Wählen Sie mit der Maus des Computers alle zu vergleichenden Sequenzen aus. Denken Sie daran, die Referenzsequenz anzugeben, die für diese Ausrichtung im Drop-Menü verwendet wird.
- Überprüfen Sie den sequenzierten Bereich auf Nukleotidänderungen im Vergleich zur Referenzsequenz. Wenn gewünscht, speichern Sie die Ausrichtung auf dem Computer im .rtf-Format, indem Sie auf Textklicken und dann speichern.
HINWEIS: Wenn keine Mutationen identifiziert würden, würde das DNA-Sequenzierungs- und Analyseprotokoll mit Primern wiederholt, die nicht-kodierende Regionen des Gens umfassen sollen.
7. Protokoll 6: Weitere Analyse der Kandidaten-Genfunktion
- Führen Sie Rettungsexperimente in Neuroblasten durch, um festzustellen, ob der Gen-Brat für den Phännotyp der Neurodegeneration verantwortlich ist.
- Doppelwaage ein UAS-brat19 und ein neuroblast-spezifisches worniu-Gal4 (wor-G4) Aktien tragen die Konstrukte auf dem dritten Chromosom, sowie die 867 Linie, die mutiert für das Gen brat befindet auf der zweiten chromosom.
- Machen Sie drei separate Kreuze, indem Sie in drei verschiedene lebensmittelhaltige Fläschchen 5 Männchen aus UAS-Brat, wor-G4 und 867 Linien und fügen Sie zu jedem Satz von Männchen 10-15 Jungfrau Weibchen aus einer Linie tragen Marker und Balancer für die zweite und dritte Chromosomen (Sp/CyO; Dr/Tm3,sb; BL_59967).
- Sammeln Sie 10-15 jungfrauen Weibchen aus der F1 jedes Kreuzes mit den folgenden Genotypen: +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, +/CyO; wor-G4/Tm3,sb und 867/CyO;+/Tm3,sb und 5 Männchen der folgenden Genotypen: +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb, +/Sp; wor-G4/Tm3,sb und 867/CyO; +/Dr.
- Kreuz collelcted +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb Jungfrauen weibchen zu +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb Männchen; in einer separaten Durchstechflasche machen ein zweites Kreuz mit +/CyO; wor-G4 /Tm3,sb jungfrauen Weibchen zu +/Sp; wor-G4/Tm3,sb Männchen und dann in einem dritten Durchstechflasche kreuz 867/CyO;+/Tm3,sb Jungfrauweibchen und 867/CyO; +/Dr Männchen.
- Sammeln Sie aus der F1 jedes dieser Kreuze sowohl Männchen als auch Weibchen der folgenden Genotypen: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb vom ersten Kreuz, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb vom zweiten Kreuz und 867/CyO; Dr/Tm3,sb vom zweiten Kreuz.
- Führen Sie eine letzte Kreuzung zwischen Brüdern und Schwestern aus jeder F1 Nachkommenschaft gesammelt, um dauerhafte Doppel ausgewogene Bestände für alle drei Linien zu etablieren.
- Kombinieren Sie UAS-brat und wor-G4 mit der 867-Mutation.
- Sammeln Sie eine ausreichende Anzahl (20-30 Fliegen) von jungfräulichen Weibchen aus dem 867/CyO; Dr/Tm3, sb doppelt ausgeglichenstock, um zwei Kreuze durchzuführen.
- Platz 10-15 Jungfrauweibchen mit 5 Männchen aus dem Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (Kreuz #1) und in einer zweiten Durchstechflasche 10-15 jungfrauen Weibchen mit 5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb Männchen.
- Sammeln Sie Brüder und Schwestern aus der F1 jedes Kreuzes mit den folgenden Genotypen: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb von Kreuz #1 und 867/CyO;wor-G4/Tm3,sb von Kreuz #2. Verwenden Sie gesammelte F1-Nachkommen aus jedem Kreuz, um dauerhafte Bestände zu schaffen, indem Sie Brüder und Schwestern zwischen ihnen kreuzen.
HINWEIS: Nach diesem letzten Schritt werden Aktien für 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb und 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb sollte generiert werden.
- Führen Sie das Rettungsexperiment durch.
- Sammeln Sie 15-20 Jungfrauen Weibchen aus dem 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb Vorrat und überqueren Sie sie zu 5-10 Männchen aus dem Bestand 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Als Kontrolle kreuzen Sie 15-20 jungfräuliche Weibchen aus dem 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb und 15-20 Jungfrauenweibchen aus dem 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb-Linie allein zur 867/CyO-Linie.
HINWEIS: 867 Fliegen tragen ein temperaturempfindliches Bratallel und das Rettungskreuz sollte bei 29 °C durchgeführt werden. - Sammeln Sie die folgende F1-Nachkommen schaft von jedem Kreuz, indem Sie sorgfältig markierten Balancer auswählen: 867/867; wor-G4/UAS-brat (Rettung), 867/867; wor-G4/+ (Kontrolle) und 867/867; UAS-brat/+ (Steuerung).
- Altern Sie die Fliegen wie gewünscht bei 29 °C und führen Sie histologische Analysen an Gehirnen durch, um nach Neurodegeneration zu suchen, indem Sie das protokollinieren, das in Abschnitt 4 (Protokoll 3) beschrieben ist.
- Sammeln Sie 15-20 Jungfrauen Weibchen aus dem 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb Vorrat und überqueren Sie sie zu 5-10 Männchen aus dem Bestand 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Als Kontrolle kreuzen Sie 15-20 jungfräuliche Weibchen aus dem 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb und 15-20 Jungfrauenweibchen aus dem 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb-Linie allein zur 867/CyO-Linie.
- Doppelwaage ein UAS-brat19 und ein neuroblast-spezifisches worniu-Gal4 (wor-G4) Aktien tragen die Konstrukte auf dem dritten Chromosom, sowie die 867 Linie, die mutiert für das Gen brat befindet auf der zweiten chromosom.
- Führen Sie eine altersabhängige Analyse der Neurodegeneration bei 867 Mutanten durch.
- Sammeln Sie 867;pcna-GFP und yw Kontrollfliegen, die ein Reportergen (pcna-GFP) tragen und bei 25°C lebensfähig sind und sowohl eine höhere Penetranz als auch eine höhere Expressivität des Neurodegeneration-Phänotyps als 867 allein aufweisen. Temperatur17.
- Altern Sie die Fliegen bis zu 5, 15 und 25, wie in Abschnitt 1.4 beschrieben, und führen Sie eine anschließende Histologieanalyse durch, indem Sie dem Protokoll in Abschnitt 4 (Protokoll 3) folgen.
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Representative Results
In diesem Aerticle stellen wir die Schritte vor, die verwendet werden, um den Genhirntumor (brat) als eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Integrität (z. B. Neuroprotektion) bei erwachsenen Fliegen17zu identifizieren; eine Methode, die verwendet werden kann, um Gene zu identifizieren, die am Neuroprotektionsschutz beteiligt sind. Wir verwendeten einen vorwärtsgenetischen Ansatz (die Strategie ist in Abbildung 1Abeschrieben), um eine Ansammlung chemisch erbtagenisierter Fliegen mit einem Klettertest zu durchforsen (der für diesen Test verwendete Apparat ist in Abbildung 1Bdargestellt). Von 235 homozygoten Linien wiesen etwa 37% der getesteten Linien eine Kletterpassrate unter 50% auf, wenn sie im Alter von 10-12 Tagen getestet wurden (Abbildung 1C). 58 % der getesteten Linien zeigten ein deutlich unterschiedliches Kletterverhalten, wenn ihre prozentuale Kletterpassrate (CPR) mit dem durchschnittlichen Anstiegsprozentwert aller getesteten Linien mit einwegigem ANOVA verglichen wurde (Abbildung 1D). Nachfolgende histologische Darstellung auf 51 der Linien mit der niedrigsten Kletterpassrate zeigte, dass 29 dieser Linien sichtbares Aussehen von Löchern im Gehirn Neuropil (von mild bis schwer) indikativ neurodegeneration20 ( Abbildung 2). Unter den Linien, die ein fehlerhaftes Kletterverhalten und eine schwere Neurodegeneration zeigen, wählen wir die Mutation, die dem Phänotyp zugrunde liegt, in Zeile 867 (0% CPR und P-Wert= 1,36e-14 basierend auf einwegiger ANOVA) abbilden. Der Neurodegeneration-Phänotyp bei 867 Fliegen ist rezessiv, da die Gehirne von heterozygoten 867 Fliegen, die zu einem wilden Stamm überkreuzt wurden, mit denen der Kontrollen vergleichbar sind (Abbildung 3A). Mittels Histologie lag die meiotische Kartierung in den 31-51 zytologischen Stellen zwischen den phänotyptischen Markern J (Jammed) und L (Lobe) auf dem zweiten Drosophila-Chromosom. Mit Hilfe des Klettertestes kartierte die Mangelzuordnung zwischen den zytologischen Positionen 31 und 51 mit Linien aus dem Drosophila-Mangelkit für Chromosom 2L (DK2L)16 die Mutation in einer Region, die 118 Gene umfasst (Abbildung3B; wobei 867/+ als Kontrolle für die statistische Analyse dient). Die Untersuchung des Hirnphänotyps von 867 Mutanten, die zu zusätzlichen Mangellinien gekreuzt wurden (Abbildung 3C), bestätigte, dass die Mutation in einem Bereich des Genoms enthalten ist, der das Gen bratenthält. Eine vollständige Liste aller zusätzlichen Gene, die in diesen Löschungen enthalten sind, finden Sie in Flybase, indem Sie auf den Link klicken, der dem gelöschten Segment zugeordnet ist (z.B. für Df(2L)ED1272 ist das gelöschte Segment 37C5-38A2). Basierend auf früheren Beobachtungen, dass Bratmutanten überzählige Zellen in ihrem Gehirn haben21, ein Phänotyp, der auch bei 867 Mutanten beobachtet wurde, wurde brat für die DNA-Sequenzierungsanalyse ausgewählt. Sanger-Sequenzierung des Bratgens, das den Exon-Kodierungsbereich enthält, identifiziert G/A-Nukleotid-Veränderung an Position 37.739 des Gens (Abbildung 4A), was zu einer Glycin-zu-Glutaminsäure-Änderung (G/E) an Position 470 des Brat-Proteins 17 führt (Abbildung 4B). Rettungsexperimente bestätigen, dass Brat eine neuroprotektive Rolle spielt, da die Überexpression des funktionellen Gens in der Linie 867 den Neurodegeneration-Phänotyp unterdrückt (Abbildung 5A). Darüber hinaus verschlechtert sich der Phänotyp bei 867 Mutanten im Laufe der Zeit, was darauf hindeutet, dass Brat eine altersabhängige Rolle im Neuroprotektionsmittel spielt17 (Abbildung 5B).
Abbildung 1 : Weiterleiten des genetischen Bildschirms zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene. (A) Bildschirmstrategie. (B) Kletterprüfgerät. (C) Kletter-Assay-Ergebnisse für Männer aus 235 homozygoten ENU-mutagenisierten Linien. Das Kreisdiagramm stellt die Anteile der getesteten Fluglinien dar, die in 4 Gruppen von Kletterpassraten fallen: 0% , 1-20% , 21-50% und 51-100% . (D) Ergebnisse aus einer 1-Wege-ANOVA-Statistik, bei der mutierte Linien mit dem durchschnittlichen Anstiegsprozentwert aller getesteten Linien verglichen wurden. Dargestellt ist die Zahl für zwei P-Wertkategorien: P < 0,05 (signifikante Änderung) und P > 0,05 (keine signifikante Änderung).
Abbildung 2 : Sekundärer Histologie-Bildschirm. H&E-gefärbte Mittelhirnabschnitte, die von links nach rechts keine Neurodegeneration, milde Neurodegeneration und bestätigte Neurodegeneration veranschaulichen. Insgesamt 51 homozygote Linien wurden durch Histologie nach Identifizierung der Kandidaten mit dem Klettertest erneut getestet. Pfeile zeigen die Löcher im Gehirn, die auf Neurodegeneration hinweisen. Die von den gepunkteten Linien umkreiste Region zeigt die schwere Neurodegenierung, die in Zeile 867 beobachtet wurde.
Abbildung 3 : Identifizierung des neuroprotektivegen Gens brat nach Derier-Mapping mit dem Klettertest. (A) Gezeigt werden repräsentative Bilder von H&E-befleckten Mittelhirnabschnitten von 18-20 Tagen alt w1118 (Control), heterozygot 867 (867/+) und homozygoten 867 mutierten Fliegen. (B) Die Mangellinie Df(2L)ED1272 (BL_24116) ergänzt den 867 mutierten Phänotyp (schwarzes Histogramm) auf der Grundlage des Kletterassays nicht. Die histologische Verifizierung zeigt, dass die Df(2L)ED1272-Linie den Phänotyp 867 neurodegeneration nicht ergänzt, während Df(2L)ED1315 (BL_9269) dies tut. Graph stellt mittelwert und Standardabweichung von 5 Kletterversuchen für jede Linie dar. Sternchen geben die Bedeutung auf der Grundlage einer einwegigen ANOVA an, bei der der durchschnittliche Anstiegsprozentwert jeder Linie mit dem durchschnittlichen Anstiegsprozentwert der Linie 867/+ (grünes Histogramm) verglichen wurde. * P < 0,05, ** P < 0,01 und ***P < 0,001. (C) Schematische Darstellung zusätzlicher Mangellinien, die eine Nichtkomplementierung des Phänotyps 867 durch histologische Angaben zeigen. Diese Zahl wurde von Loewen et al.17geändert; einen Artikel, der unter der Creative Commons Attribution 4.0 International License veröffentlicht wurde.
Abbildung 4 : Punktmutation in der brat führt zu einer Aminosäureveränderung in der Coiled-Coil-Domäne des Brat-Proteins. (A) Brat-Genmodell und Primer, die für die Verstärkung und Sequenzierung des Kodierungsbereichs verwendet werden. (B) DNA-Sequenzierung des Ratten-Lokus identifiziert eine Nukleotid-Änderung, die zu einer Aminosäureveränderung in der Coiled Coil-Domäne des Brat-Proteins führt. Diese Zahl wurde von Loewen et al.17geändert; einen Artikel, der unter der Creative Commons Attribution 4.0 International License veröffentlicht wurde.
Abbildung 5 : Weitere Analyse der brat Mutanten bestätigt seine neuroprotektive Rolle bei der Drosophila. (A) Mit dem Gal-4>UAS-System22 rettet die neuroblast-spezifische Expression des funktionellen Bratgens den Neurodegeneration-Phänotyp bei 867 Mutanten. (B) Die altersabhängige Neurodegeneration wird bei 867 Mutanten beobachtet, die ein Reportergen pcna-GFPtragen. bratchs entspricht dem Namen des Bratalleels in der Zeile 867, das Käsekopf (chs) genannt wurde. Gezeigt werden repräsentative H&E-gefärbte Mittelhirnabschnitte von yw (Kontrolle) und homozygoten Bratchs;pcna-GFP Fliegen der angegebenen Altersgruppen. Diese Zahl wurde von Loewen et al.17geändert; einen Artikel, der unter der Creative Commons Attribution 4.0 International License veröffentlicht wurde.
| haltestelle | zeit | temperatur | Vakuum/Druck | lösung |
| 1 | KEIN VERZÖGERUNGS-SCHNELLSTART | |||
| 2 | weg | weg | weg | |
| 3 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 80%EtOH |
| 4 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 95% EtOH |
| 5 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 100% EtOH |
| 6 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 100% EtOH |
| 7 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 100% EtOH |
| 8 | : 15 | 37 °C | ON/ON | Xylenes |
| 9 | : 15 | 37 °C | ON/ON | Xylenes |
| 10 | : 15 | 37 °C | ON/ON | Xylenes |
| 11 | : 30 | 58 °C | ON/ON | paraffin |
| 12 | : 15 | 58 °C | ON/ON | paraffin |
| 13 | weg | 58 °C | weg | paraffin |
| 14 | : 15 | 58 °C | ON/ON | paraffin |
Tabelle 1: Empfohlene Programmeinstellungen für den automatisierten Tissueprozessor. Die Schritte in der hier aufgeführten Reihenfolge können mit einem automatisierten Tissueprozessor für festinstallierte Köpfe verwendet werden.
| Reagenz | Volumen (L) |
| 10x ExTaq Puffer (Mg2+ plus) (20 mM) | 2,5 |
| Vorwärtsgrundierung (10 'M) | 2,5 |
| Reverse Primer (10 'M) | 2,5 |
| 2,5 mM dNTPs | 2 |
| Template-DNA | 2 |
| TaKaRa Ex Tq (5 U/l) | 0,25 |
| Nukleasefreies Wasser | 13.25 Uhr |
| Gesamtvolumen | 25 |
Tabelle 2: Reagenzien für die PCR-Reaktion. Reagenzien und entsprechende Volumina, die in der PCR-Reaktion verwendet werden, um den Brat-Codierungsbereich zu verstärken.
| schritt | temperatur | zeit |
| 35 Zyklen | 95 °C | 15 s |
| 55 °C | 45 s | |
| 72 °C | 3 min 10 s | |
| halten | 4 °C | ∞ |
Tabelle 3: Thermische Fahrradbedingungen für PCR. Die Schritte in der hier aufgeführten Reihenfolge können verwendet werden, um einen thermischen Cycler mit dem in Tabelle2dargestellten Reaktionsmix zu programmieren.
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Discussion
Forward genetische Screens in Drosophila waren ein effektiver Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich altersabhängiger Neuroprotektion5,23,24, 25. Mit dieser Strategie gelang es uns, Brat als neuartiges neuroprotektives Gen zu identifizieren17.
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll beinhaltet die richtige Ausrichtung der Köpfe (wie in Abschnitt 4.4.3.beschrieben) für die Histologieanalyse. Darüber hinaus sollten Marker der Für die meiotische Kartierung verwendeten Linie den Phänotyp der neuen Mutation nicht stören (in dieser Studie: Neurodegeneration). Wir empfahlen einen ersten Test, um zu bestätigen, dass die gewählten Marker keine eigene Neurodegeneration verursachen. Zum Beispiel verursacht Jammed (J) Flügelblasen, die möglicherweise das Klettern stören könnten, wie es bei Amyloid-Vorläuferprotein (APP)-überexemitierenden Fliegen der Fall ist, die auch Blasenflügel haben26. Lobe (L) führt zu einer Verringerung der Augengröße; Wir beobachten jedoch keine zentrale Degeneration des Gehirns und dieser Marker kann verwendet werden, um die zentrale Neurodegeneration des Gehirns abzubilden. Pin und Sternoplural (Sp) sind auch geeignet zu verwenden, da Gehirne von Fliegen, die diese Marker tragen, mit Gehirnen wilder Typkontrollen vergleichbar sind.
Ein Nachteil der vorwärts genetischen Methodik bei Fliegen ist die Länge der Zeit, die benötigt wird, um DNA-Regionen auf das Gen von Interesse zu verengen3,5. Der Einsatz verbesserter Kartierungsstrategien27 zusammen mit der Verfügbarkeit von Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation 28 sollte eine noch einfachere Identifizierung von Mutationen ermöglichen, die mit Phänotypen von Interesse verbunden sind. Vorwärts genetische Bildschirme können arbeitsintensiv sein. Zum Beispiel erfordert die histologische Bestätigung, die direkt auf Neurodegeneration im Gehirn absagt, allein eine beträchtliche Zeit. Allerdings wird dieser Ansatz viel schwieriger und teurer in Säugetiermodellen durchgeführt werden, nicht unbedingt erlauben umfangreiche genetische Studien. Chemische Mutagenese-Screens sind von Vorteil, da die Identifizierung von Punktmutationen wichtige Informationen über die Funktion der Produkte der betroffenen Gene liefern könnte. Die Identifizierung einer Punktmutation, die eine Aminosäureänderung in einer konservierten Domäne des Brat-Proteins verursacht (Abbildung 4B) zeigt die Bedeutung der Coiled-Coil-Domäne dieses TRIM-NHL-Proteins im Neuroprotektion sanieren18. Der Klettertest, der das Bewegungsverhalten misst, ist sicherlich von Vorteil, da er eine schnelle Prüfung einer großen Anzahl von Fliegen auf Defekte in der Mobilität ermöglicht, die auch häufig bei der menschlichen Neurodegeneration25zu beobachten sind. Dieser Test könnte auch in einer anderen Bildschirmeinstellung durchgeführt werden, wie z. B. genomweite in vivo RNA Interferenz (RNAi) Bildschirm, die verwendet werden könnte, um neuroprotektive Gene zu identifizieren. Obwohl wir den Abstand zwischen dem Boden der Prüfkammer und der Durchgangslinie von 8 cm10 bis 5 cm verringerten, um in der vorliegenden Studie eine strengere Passrate festzulegen, spiegelten niedrige Kletterraten die Neurodegeneration für eine große Anzahl von Linien nicht wider. Neurodegeneration kann nach dem Auftreten von Verhaltensstörungen sichtbar werden, was bedeutet, dass Fliegen möglicherweise länger gealtert werden müssen, bevor Vakuolen auftreten. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die Bewegungsstörungen, die wir in bestimmten Linien beobachten, nicht auf eine defekte neurologische Funktion zurückzuführen sind, sondern auf Muskelschwäche oder allgemeinere Untauglichkeit der Fliegen. Darüber hinaus ist es möglich, dass uns potenzielle Kandidaten fehlen, bei denen sich Kletterfehler nicht im jüngeren Alter (z.B. 10 Tage alt) manifestieren, sondern später im Leben prominent werden. Diese Screening-Strategie könnte sicherlich angewendet werden, um altersabhängige Gene zu identifizieren und so Gene zu beseitigen, die mit potenziellen Defekten der neuronalen Entwicklung verbunden sind. Das hier vorgestellte Protokoll kann abhängig von der gewünschten Wahrscheinlichkeit von Kandidatenlinien angepasst werden, um das mutierte Gen zu enthalten, das an der Neuroprotektion beteiligt ist. Die direkte Senkung der Passing-Rate-Schwelle ist ein weiteres Mittel, um das gleiche Ergebnis zu erzielen. Diese Kandidaten würden theoretisch eine größere Neurodegeneration aufweisen, was Zeit und Ressourcen während der Bestätigung und Kartierung sparen könnte.
Im Allgemeinen beschreibt das Protokoll eine einfache Möglichkeit, auf Neurodegeneration zu überprüfen und anschließend neuroprotektive Genkandidaten zu identifizieren. Dieser genetische Ansatz beschränkt sich nicht auf das hier beschriebene Verhalten und histologische Assays und kann auch verwendet werden, um andere Phänotypen wie temperaturempfindliche (ts) Lähmungen, Eiablage oder Fruchtbarkeitsphänotypen zu überprüfen, um nur einige zu zitieren. Zum Beispiel, Drosophila ts-paralytische Mutanten sind dafür bekannt, für Neurodegeneration29 angereichert und könnte eine zusätzliche Quelle für die Identifizierung von neuroprotektive Gene darstellen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Besonders dankbar sind wir Dr. Barry Ganetzky, in dessen Labor der genetische Bildschirm durchgeführt wurde, der die Identifizierung und Charakterisierung von Brat als neuroprotektives Gen ermöglicht. Wir danken Dr. Steven Robinow für die freundlicherweise Bereitstellung der Sammlung von ENU-mutagenisierten Fliegen, die in dem in diesem Artikel vorgestellten genetischen Bildschirm verwendet werden. Wir danken den Mitgliedern des Ganetzky-Labors, Drs. Grace Boekhoff-Falk und David Wassarman für die hilfreichen Diskussionen während der gesamten Dauer dieses Projekts, Ling Ling Ho und Bob Kreber für technische Hilfe, Dr. Aki Ikeda für die Nutzung seiner Mikrotome-Anlage an der University of Wisconsin und Dr. Kim Lackey and the Optical Analysis Facility at the University of Alabama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
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