Injektion af Gryllus-bimaculatus -æg
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at injicere cricket æg, en teknik, der tjener som en fundamentale metode i mange eksperimenter i cricket, herunder, men ikke begrænset til, RNA-interferens og genommanipulation.
Abstract
Ændring af genfunktion i en udvikler organisme er afgørende for forskellige former for eksperimenter. Mens uhyre kraftfulde genetiske værktøjer er blevet udviklet i traditionelle modelsystemer, er det vanskeligt at manipulere gener eller Messenger RNA (mRNA) i de fleste andre organismer. Samtidig er evolutionære og komparative tilgange afhængige af en udforskning af genfunktion i mange forskellige arter, hvilket nødvendiggør udvikling og tilpasning af teknikker til manipulation af udtryk uden for nuværende genetisk Tractable Arter. Denne protokol beskriver en metode til injektion af reagenser i cricket æg til analyse af virkningerne af en given manipulation på embryonale eller larve udvikling. Instruktioner til, hvordan man samler og injicerer æg med affasede nåle, er beskrevet. Denne relativt ligetil teknik er fleksibel og potentielt tilpasningsdygtig til andre insekter. Man kan samle og injicere snesevis af æg i et enkelt eksperiment, og overlevelsesrater for buffer-only injektioner forbedres med praksis og kan være så højt som 80%. Denne teknik vil understøtte flere typer af eksperimentelle tilgange, herunder injektion af farmakologiske midler, in vitro-udjævnet mRNA at udtrykke gener af interesse, dobbelt-strandede RNA (dsRNA) for at opnå RNA-interferens, brug af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske gentagelser (crispr) i koncert med crispr-associerede protein 9 (Cas9) reagenser til genomisk modifikation, og overføres elementer til at generere forbigående eller stabile transgene linjer.
Introduction
Evnen til at ændre genomet eller påvirke genekspression i organismer er grundlaget for udformningen af mange typer eksperimenter, der tester funktionel kausalitet. Det er også afgørende for det komparative og evolutionært relevante arbejde, at genomiske og ikke-genomiske modifikations teknikker er tilgængelige i organismer uden for traditionelle genetiske laboratoriesystemer for dyremodeller (f. eks. mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans). Uanset om det er ønsket om at forstå organisme mangfoldighed1 eller ens tilslutning til Kroghs princip, at der for hvert biologisk spørgsmål er en organisme bedst egnet til sin løsning2,3, evnentil at ændre genomer eller indflydelse genekspression er afgørende for moderne eksperimentelle designs.
Cricket Gryllus bimaculatus er et spirende model system. Anvendes til det sidste århundrede i Neuro eksperimenter4, de sidste to årtier har været vidne til en øget eksperimentel interesse i cricket, især fokuseret på udviklingen og udviklingen af denne organisme5. Cricket er et hemimetabolous insekt, der grene basale til godt studeret holometabolous insekter, såsom D. melanogaster og tribolium castaneum6. På grund af sin nyttige position på det evolutionære træ, videnskabsfolk er interesseret i at spørge moderne, sofistikerede eksperimentelle spørgsmål i dette insekt, som har ført til en stigende interesse i at tilpasse molekylære værktøjer til brug i G. bimaculatus.
Injektioner af molekylære reagenser i cricket æg kan anvendes til genommodificering eksperimenter samt ikke-genomisk manipulationer af genekspression i embryoner. For eksempel, transgene G. bimaculatus transporterer egfp indsættelser er blevet oprettet ved hjælp af transposase piggybac7,8. Efterforskerne har med succes skabt knockout G. bimaculatus ved hjælp af zink finger-nukleaser (zfns) og transkriptionsaktivator-lignende (tal) Effector Nucleaser (talens) for at indføre dobbelt strandede pauser i specifikke genomområder9. Selvom ZFNs og TALENs tillader websteds specifik målretning i dyr ud over de fire store modelsystemer, er disse reagenser hurtigt blevet overgået af CRISPR/Cas9-systemet, som er enklere at bruge, mere effektivt og yderst fleksibelt10. Crispr har været anvendt i G. bimaculatus til at producere knock-out11 samt Knock-in linjer12,13 foruden genomisk modifikation kan dsRNA injiceres i æg for at vælte mRNA-ekspression i udviklings embryoer, så efterforskerne kan forstå rollen for specifikke udskrifter gennem udvikling14,15. Nogle begrænsede detaljer om, hvordan man injicere cricket æg er blevet offentliggjort tidligere12.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til indsprøjtning af tidlige G. bimaculatus -æg. Denne protokol er effektiv og let at tilpasse til forskellige laboratorie indstillinger, injektion materialer, og eventuelt til andre insekter. Mens yderligere detaljer for at designe og gennemføre genomændringer og Knockdown eksperimenter er blevet offentliggjort andetsteds12,13, vil disse tilgange i sidste ende afhænge af injektion protokol detaljeret her.
Protocol
Representative Results
Discussion
De to vigtigste udfordringer med denne teknik er de relaterede spørgsmål af optimal nål størrelse og overlevelsesevne. Selv om mindre nåle forbedre overlevelsesevne, nåle med smallere lumen har en større grad af kapillar kræfter på arbejdspladsen, hvilket gør det mere sandsynligt, at æggeblomme vil bevæge sig ind i nålen forårsager det at tilstoppe. I bedste fald kan blokeringer ryddes ved blot at injicere et andet æg eller ved at rydde nålen som beskrevet ovenfor. Man kan også forsøge at øge balancen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapporteret i dette projekt blev støttet af en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af de nationale institutter for sundhed under Grant nummer P20GM10342 til HH3, og af NSF Award nummer IOS-1257217 til Cge.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. . Cricket neurobiology and behavior. , (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. . The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
