הזרקת גרללוס ביצי ביצה
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.
Abstract
שינוי תפקוד הגנים באורגניזם מתפתח הוא מרכזי סוגים שונים של ניסויים. בעוד כלים גנטיים מאוד חזק פותחו במערכות מודל מסורתיות, קשה לתמרן גנים או שליח RNA (mRNA) ברוב האורגניזמים האחרים. במקביל, גישות אבולוציונית והשוואתית להסתמך על חקר של תפקוד גנטי במינים שונים רבים, המחייב פיתוח והסתגלות של טכניקות לתמרן הבעה מחוץ כרגע מעוקב גנטי ינים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להזרקת ריאגנטים לתוך ביצי קריקט כדי לעבד את ההשפעות של מניפולציה נתונה על התפתחות עובריים או זחל. הוראות כיצד לאסוף ולהזריק ביצים עם מחטים משופע מתוארים. הטכניקה הפשוטה יחסית היא גמישה ועשויה להיות מתכווננת לחרקים אחרים. אפשר לאסוף ולהזריק עשרות ביצים בניסוי אחד, ושיעורי ההישרדות לזריקות מאגר בלבד לשפר עם התרגול יכול להיות גבוה כמו 80%. טכניקה זו תתמוך מספר סוגים של גישות ניסיוני כולל הזרקה של סוכני תרופתי, ב-mRNA מתורבת לבטא גנים של עניין, כפול תקוע RNA (dsRNA) כדי להשיג הפרעות RNA, השימוש באשכולות באופן סדיר במרווחים קצר palindromic חוזר (CRISPR) בקונצרט עם CRISPR הקשורים חלבון 9 (Cas9) ריאגנטים עבור שינוי גנומית, ורכיבים טרנספראבל כדי ליצור קווי טרנסגניים ארעי או יציב.
Introduction
היכולת לשנות את הגנום או השפעה הביטוי הגן באורגניזמים הוא הבסיס לעיצוב של סוגים רבים של ניסויים בדיקת סיבתיות תפקודית. הוא גם קריטי לעבודה השוואתית ואבולוציונית הרלוונטית שטכניקות שינוי גנומית ושאינן גנוגנות יהיו זמינות באורגניזמים מחוץ למערכות מודל גנטיות מסורתיות בעלי חיים מעבדה (למשל, Mus מוסקולוס, דניו ראריו, דרוזופילה מלאנוגסטר, ואלבורחבאבדיטיס. בין אם מדובר ברצון להבין את הגיוון האורגאיאלי1 או את הדבקות בעיקרון של krogh, כי עבור כל שאלה ביולוגית יש אורגניזם המתאים ביותר לפתרון2,3, היכולת לשנות גנום או השפיע על ביטוי הגנים חיוני לעיצובים ניסיוניים מודרניים.
הצרצר הקריקט הוא מערכת מודל המתעוררים. במהלך המאה האחרונה בניסויים נוירואתולוגיה4, שני העשורים האחרונים היו עדים לעניין ניסיוני מוגבר בקריקט, התמקד בעיקר באבולוציה ובהתפתחות של האורגניזם הזה5. הצרצר הוא חרק מיני המסתעף בholometabolous לחרקים בעלי לימודים היטב, כגון ד. מלאנוגסטר וטריבוליום6. בשל עמדתה השימושית על העץ האבולוציוני, מדענים מעוניינים לשאול שאלות נסיוניות מודרניות ומתוחכמות בחרק זה, אשר הוביל לעניין הולך וגובר בהתאמת כלים מולקולריים לשימוש ב -G. בימרו.
זריקות של ריאגנטים מולקולרי לתוך ביצי קריקט יכול לשמש ניסויים שינוי גנומית, כמו גם מניפולציות שאינן גנומית של הביטוי גנים העוברים. לדוגמה, הטרנסגניים G. בימרו על נושאים הוספות egfp נוצרו באמצעות הטרנספססה 7,8. החוקרים יצרו בהצלחה את הנוקאאוט G. בימרו שימוש בנוקלאוסים לאצבעות אבץ (ZFNs) ותמלול activator-כמו (טל) (talens) כדי להחדיר כפול תקוע הפסקות באזורים גנומית ספציפיים9. למרות ZFNs ו TALENs לאפשר פילוח ספציפי לאתר בעלי חיים מעבר מערכות ארבע מודל גדול, אלה ריאגנטים במהירות העלתה על ידי CRISPR/Cas9 system, אשר פשוט לשימוש, יעיל יותר, וגמיש מאוד10. Crispr שימש ב -G. בימרו כדי לייצר נוק אאוט11 , כמו גם להקיש על קווים12,13 בנוסף שינוי גנומית, dsrna ניתן להזריק ביצים כדי להפיל ביטוי mrna בפיתוח עוברים, המאפשרים לחוקרים להבין את התפקיד של תעתיקים ספציפיים במהלך פיתוח14,15. כמה פרטים מוגבלים על איך להזריק ביצי קריקט פורסמו בעבר12.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להזרקת ביצים מוקדמות. פרוטוקול זה יעיל וניתן בקלות להתאמה להגדרות מעבדה שונות, חומרי הזרקה, ואולי חרקים אחרים. בעוד פרטים נוספים עבור עיצוב ויישום של שינוי גנומית וניסויים בהוצאת מפורסמים פורסמו במקומות אחרים12,13, גישות אלה בסופו של דבר להסתמך על פרוטוקול ההזרקה מפורט כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
שני האתגרים העיקריים עם טכניקה זו הם הנושאים הקשורים של גודל מחט אופטימלית ושרידות. למרות מחטים קטנות לשפר את ההישרדות, מחטים עם צר לומן יש מידה רבה יותר של כוחות קפילר בעבודה, מה שהופך אותו סביר יותר כי החלמון יהיה לעבור לתוך המחט גורמת לו לסתום. במקרה הטוב, ניתן לנקות חסימות פשוט על-ידי הז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקרים שדווחו בפרויקט זה נתמך על ידי פרס פיתוח מוסדי (רעיון) מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר מענק P20GM10342 כדי HH3, ועל ידי NSF מספר הפרס IOS-1257217 . בסדר.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. . Cricket neurobiology and behavior. , (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. . The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
