Iniezione di uova di Gryllus bimaculatus
Summary
Qui presentiamo un protocollo per iniettare uova di cricket, una tecnica che serve come metodo fondamentale in molti esperimenti nel cricket, tra cui, ma non solo, l’interferenza dell’RNA e la manipolazione genomica.
Abstract
L’alterazione della funzione genica in un organismo in via di sviluppo è fondamentale per diversi tipi di esperimenti. Sebbene siano stati sviluppati strumenti genetici estremamente potenti nei sistemi modello tradizionali, è difficile manipolare i geni o l’RNA messaggero (mRNA) nella maggior parte degli altri organismi. Allo stesso tempo, gli approcci evolutivi e comparativi si basano su un’esplorazione della funzione genica in molte specie diverse, che richiede lo sviluppo e l’adattamento di tecniche per manipolare l’espressione al di fuori attualmente geneticamente trattabile specie. Questo protocollo descrive un metodo per iniettare reagenti nelle uova di cricket per esaminare gli effetti di una data manipolazione sullo sviluppo embrionale o larvale. Vengono descritte le istruzioni per la raccolta e l’iniezione di uova con aghi smussati. Questa tecnica relativamente semplice è flessibile e potenzialmente adattabile ad altri insetti. Si può raccogliere e iniettare decine di uova in un singolo esperimento, e i tassi di sopravvivenza per iniezioni tampone-solo migliorare con la pratica e può essere alto come 80%. Questa tecnica sosterrà diversi tipi di approcci sperimentali, tra cui l’iniezione di agenti farmacologici, l’mRNA in vitro con limite per esprimere geni di interesse, l’RNA a doppio filamento (dsRNA) per ottenere l’interferenza dell’RNA, l’uso di cluster regolarmente ripetizioni palindromiche brevi interspaziose (CRISPR) in concerto con reagenti di proteina 9 (Cas9) associati a CRISPR per la modifica genomica e elementi trasponibili per generare linee transgeniche transitorie o stabili.
Introduction
La capacità di modificare il genoma o influenzare l’espressione genica negli organismi è la base per la progettazione di molti tipi di esperimenti che testano la causalità funzionale. È inoltre fondamentale per il lavoro comparativo ed evolutivamente rilevante che le tecniche di modifica genomica e non genomica siano disponibili negli organismi al di fuori dei tradizionali sistemi genetici del modello animale (ad esempio, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, e Caenorhabditis elegans). Che si tratti del desiderio di comprendere la diversità dell’organismo1 o dell’adesione al principio di Krogh, che per ogni questione biologica c’è un organismo più adatto alla sua soluzione2,3,la capacità di modificare i genomi o influenzare l’espressione genica è essenziale per i moderni progetti sperimentali.
Il cricket Gryllus bimaculatus è un sistema modello emergente. Utilizzato per il secolo scorso in esperimenti neurologici4, gli ultimi due decenni hanno visto un crescente interesse sperimentale per il cricket, particolarmente focalizzato sull’evoluzione e lo sviluppo di questo organismo5. Il grillo è un insetto emimetabolo che si dirama a livello basaleto a insetti olometaboli ben studiati, come D. melanogaster e Tribonocastaneum6. A causa della sua posizione utile sull’albero evolutivo, gli scienziati sono interessati a porre domande sperimentali moderne e sofisticate in questo insetto, che ha portato a un crescente interesse nell’adattamento degli strumenti molecolari per l’uso in G. bimaculatus.
Le iniezioni di reagenti molecolari negli ovuli da cricket possono essere utilizzate per esperimenti di modificazione genomica e manipolazioni non genomiche dell’espressione genica negli embrioni. Ad esempio, sono stati creati transgenici G. bimaculatus che trasportano gli inserimenti eGFP utilizzando il piggyBac7,8. I ricercatori hanno creato con successo G. bimaculatus con nucleasi di dito di zinco (FN) e nuclee effettore (TAL) simili a istruzioni di trascrizione (TALEN) per introdurre rotture a doppio filamento in specifiche regioni genomiche9. Anche se le nomi di rete e i TALEN consentono il targeting specifico del sito in animali oltre i quattro grandi sistemi modello, questi reagenti sono stati rapidamente superati dal sistema CRISPR/Cas9, che è più semplice da usare, più efficiente e altamente flessibile10. CRISPR è stato utilizzato in G. bimaculatus per produrre knock-out11 così come knock-in linee12,13 Oltre alla modificazione genomica, dsRNA può essere iniettato nelle uova per abbattere l’espressione mRNA in sviluppo embrioni, consentendo ai ricercatori di comprendere il ruolo delle trascrizioni specifiche durante lo sviluppo14,15. Alcuni dettagli limitati su come iniettare uova di cricket sono stati pubblicati in precedenza12.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l’iniezione di uova di G. bimaculatus precoce. Questo protocollo è efficace e facilmente adattabile a varie impostazioni di laboratorio, materiali di iniezione ed eventualmente ad altri insetti. Sebbene siano stati pubblicati ulteriori dettagli per la progettazione e l’implementazione di esperimenti di modifica e knockdown, pubblicati altrove12,13, questi approcci alla fine si baseranno sul protocollo di iniezione descritto qui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le due sfide principali con questa tecnica sono le questioni correlate di dimensioni ottimali dell’ago e sopravvivenza. Anche se gli aghi più piccoli migliorano la sopravvivenza, gli aghi con lumen più stretti hanno un maggior grado di forze capillari al lavoro, il che rende più probabile che il tuorlo si muova nell’ago causandone l’intasare. Nel migliore dei casi, i blocchi possono essere eliminati semplicemente iniettando un altro uovo o cancellando l’ago come descritto sopra. Si può anche tentare di aumentare la p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questo progetto è stata sostenuta da un Premio per lo Sviluppo Istituzionale (IDeA) dell’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con numero di sovvenzione P20GM10342 a HH3, e dal numero di premio NSF IOS-1257217 a Della CGE.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
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