Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Injektion von Cricket-Eiern vor, eine Technik, die als grundlegende Methode in vielen Experimenten im Cricket dient, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA-Interferenz und genomische Manipulation.
Abstract
Die Veränderung der Genfunktion in einem sich entwickelnden Organismus ist für verschiedene Arten von Experimenten von zentraler Bedeutung. Während in traditionellen Modellsystemen enorm leistungsfähige genetische Werkzeuge entwickelt wurden, ist es in den meisten anderen Organismen schwierig, Gene oder Boten-RNA (mRNA) zu manipulieren. Gleichzeitig basieren evolutionäre und vergleichende Ansätze auf einer Erforschung der Genfunktion bei vielen verschiedenen Arten, was die Entwicklung und Anpassung von Techniken zur Manipulation von Expressionen außerhalb der derzeit genetisch behördlichen Spezies. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Injektion von Reagenzien in Cricket-Eier, um die Auswirkungen einer bestimmten Manipulation auf die embryonale oder Larvenentwicklung zu testen. Anweisungen zum Sammeln und Injizieren von Eiern mit abgeschrägten Nadeln werden beschrieben. Diese relativ einfache Technik ist flexibel und potenziell an andere Insekten anpassbar. Man kann Dutzende von Eiern in einem einzigen Experiment sammeln und injizieren, und die Überlebensraten für Pufferinjektionen verbessern sich mit der Praxis und können bis zu 80% betragen. Diese Technik unterstützt verschiedene Arten von experimentellen Ansätzen, einschließlich der Injektion von pharmakologischen Wirkstoffen, in vitro capped mRNA, um Gene von Interesse auszudrücken, doppelsträngige RNA (dsRNA), um RNA-Interferenzen zu erreichen, die Verwendung von clusterierten regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) in Abstimmung mit CRISPR-assoziierten Protein-9 (Cas9)-Reagenzien zur genomischen Modifikation und transposierbaren Elementen zur Erzeugung transienter oder stabiler transgener Linien.
Introduction
Die Fähigkeit, das Genom zu modifizieren oder die Genexpression in Organismen zu beeinflussen, ist die Grundlage für die Entwicklung vieler Arten von Experimenten, die funktionelle Kausalität testen. Entscheidend für die vergleichende und evolutionär relevante Arbeit ist auch, dass genomische und nicht-genomische Modifikationstechniken in Organismen außerhalb traditioneller genetischer Labortiermodellsysteme (z. B. Mus musculus, Danio) verfügbar sind. rerio, Drosophila melanogasterund Caenorhabditis elegans). Ob es der Wunsch ist, die Vielfalt des Organismus zu verstehen1 oder die Einhaltung des Krogh-Prinzips, dass es für jede biologische Frage einen Organismus gibt, der am besten zu seinerLösung2,3, der Fähigkeit, Genome zu modifizieren oder Einfluss auf die Genexpression ist für moderne Experimentelle Designs unerlässlich.
Der Cricket Gryllus bimaculatus ist ein aufstrebendes Modellsystem. Verwendet für das letzte Jahrhundert in neuroethologischen Experimenten4, die letzten zwei Jahrzehnte haben ein erhöhtes experimentelles Interesse an der Cricket erlebt, vor allem auf die Entwicklung und Entwicklung dieses Organismuskonzentriert 5. Die Cricket ist ein hemimetabolous Insekt, das basal zu gut untersuchten holometabolen Insekten, wie D. melanogaster und Tribolium castaneum6. Aufgrund seiner nützlichen Position auf dem Evolutionsbaum sind Wissenschaftler daran interessiert, moderne, anspruchsvolle experimentelle Fragen an diesem Insekt zu stellen, was zu einem wachsenden Interesse an der Anpassung molekularer Werkzeuge für den Einsatz in G. bimaculatusgeführt hat.
Injektionen molekularer Reagenzien in Cricket-Eier können für genomische Modifikationsexperimente sowie nicht-genomische Manipulationen der Genexpression in Embryonen verwendet werden. Zum Beispiel wurden transgene G. bimaculatus tragen degfP Insertionen wurden mit der Transposase piggyBac7,8erstellt. Die Forscher haben erfolgreich Knockout G. bimaculatus mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-ähnlichen (TAL) Effektornukleasen (TALENs) erstellt, um doppelsträngige Brüche in bestimmten Genomregionen einzuführen9. Obwohl ZFNs und TALENs ortsspezifisches Targeting bei Tieren über die großen vier Modellsysteme hinaus ermöglichen, wurden diese Reagenzien schnell durch das CRISPR/Cas9-System übertroffen, das einfacher zu bedienen, effizienter und hochflexiblerist 10. CRISPR wurde in G. bimaculatus zur Herstellung von Knock-out11 sowie Knock-in-Linien12,13 Zusätzlich zur genomischen Modifikation kann dsRNA in Eier injiziert werden, um die mRNA-Expression bei der Entwicklung Embryonen, so dass die Forscher die Rolle der spezifischen Transkripte während der Entwicklung verstehen14,15. Einige begrenzte Details über die Injektion von Cricket-Eiern wurden bereits veröffentlicht12.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Injektion früher G. bimaculatus Eier. Dieses Protokoll ist effektiv und leicht an verschiedene Laboreinstellungen, Injektionsmaterialien und möglicherweise an andere Insekten anpassbar. Während zusätzliche Details für die Gestaltung und Umsetzung von Genommodifikations- und Knockdown-Experimenten an anderer Stelle veröffentlicht wurden12,13, werden diese Ansätze letztlich auf das hier beschriebene Injektionsprotokoll angewiesen sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beiden größten Herausforderungen bei dieser Technik sind die damit verbundenen Fragen der optimalen Nadelgröße und Überlebensfähigkeit. Obwohl kleinere Nadeln die Überlebensfähigkeit verbessern, haben Nadeln mit schmaleren Lumen ein höheres Maß an Kapillarkräften bei der Arbeit, was es wahrscheinlicher macht, dass sich Dasgelb in die Nadel bewegt, wodurch es verstopft wird. Im besten Fall können Verstopfungen einfach durch Injektion eines anderen Eis oder durch Löschen der Nadel wie oben beschrieben bese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in diesem Projekt berichtete Forschung wurde durch einen Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM10342 bis HH3 und durch die NSF-Vergabenummer IOS-1257217 an Cge.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
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