DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb
Summary
Protein binding microarray (PBM) eksperimenter kombineret med biokemiske assays forbinder bindende og katalytiske egenskaber af DNA primase, et enzym, der syntetiserer RNA primere på Template DNA. Denne metode, der er udpeget som et højt gennemløb primase profilering (HTPP), kan bruges til at afsløre DNA-bindende mønstre af en række enzymer.
Abstract
DNA primase syntetiserer korte RNA primere, der initierer DNA-syntese af Okazaki fragmenter på den tilbagestående streng ved DNA-Polymerase under DNA-replikering. Bindingen af prokaryote dnag-lignende primases til DNA sker ved en specifik trinucleotid genkendelsessekvens. Det er et afgørende skridt i dannelsen af Okazaki fragmenter. Konventionelle biokemiske værktøjer, der anvendes til at bestemme DNA-genkendelse sekvens af DNA primase giver kun begrænset information. Ved hjælp af en mikroarray baseret bindings test med høj gennemløb og på hinanden følgende biokemiske analyser er det blevet påvist, at 1) den specifikke bindende kontekst (flankensekvens af anerkendelses stedet) påvirker DNA-primases bindende styrke til dens skabelon DNA, og 2) stærkere binding af primase til DNA giver længere RNA primere, hvilket indikerer højere processivitet af enzymet. Denne metode kombinerer PBM og primase Activity assay og er udpeget som høj gennemløb primase profilering (HTPP), og det giver mulighed for karakterisering af specifikke sekvens genkendelse af DNA primase i hidtil uset tid og skalerbarhed.
Introduction
HTPP gør brug af DNA binding microarray teknologi kombineret med biokemisk analyse (figur 1) til statistisk at identificere specifikke funktioner i DNA-skabeloner, der påvirker den enzymatiske aktivitet af DNA primase. Derfor giver HTPP en teknologisk platform, der letter et videnspring i marken. De klassiske værktøjer, der anvendes til at bestemme primase anerkendelse sites ikke har evnen til at give massive mængde data, mens HTPP gør.
PBM er en teknik, der rutinemæssigt anvendes til at bestemme de bindende præferencer for transkriptionsfaktorer til DNA1,2; Det er dog ikke egnet til påvisning af svag/forbigående binding af proteiner til DNA. I modsætning til Universal PBM, der giver oplysninger om gennemsnitlig proteinbinding specificitet til alle mulige sekvenser bestående af otte base par, er HTPP baseret på biblioteket af enkelt-strandede DNA-skabeloner, der omfatter unikke sekvens elementer. Sådanne DNA sekvens elementer involverer titusinder kort (få snesevis af BP) genomiske sekvenser, samt computationelt designede DNA-sekvenser beriget i visse DNA gentagne sekvens elementer til stede i genomet, som besidder forskellige gennemsnitlige GC indhold . En sådan tilgang med høj gennemløb gør det muligt på en systematisk, kvantitativ og hypotese drevet måde at fastslå de sekvens relaterede egenskaber, der er vigtige for primase binding og dens enzymatiske aktivitet3. Navnlig er den vigtige forbindelse mellem primase-DNA-bindende præferencer (moduleret af DNA-sekvenser, der flanserer specifikke Tri-nucleotid-bindingssteder) og primase processivitet blevet identificeret for dette enzymatiske system4.
Den nye teknologi blev anvendt til at revidere vores forståelse af primase anerkendelse sites selv for T7 DNA primase, der er blevet grundigt undersøgt5. Specifikt, re-undersøgelse af klassiske begreber, såsom DNA-anerkendelse sites af T7 DNA primase (som blev fastsat næsten fire årtier siden 6) ved hjælp af protein-DNA binding microarray (PBM) har ført til hidtil uset indsigt i funktioner relateret til den ledsage sekvens af disse anerkendelse sites3. Det blev forventet, at sekvenser ledsage Tri-nucleotid anerkendelse site af T7 DNA primase (5 ‘-GTC-3 ‘) vil være tilfældig. I stedet, vi fandt, at TG-rige flankerende sekvenser øge chancerne for T7 DNA primase at syntetisere længere RNA primere indikerer en stigning i processivitet.
Andre metoder, der kan anvendes til at studere DNA-bindende egenskaber af proteiner in vitro omfatter den elektroforetiske mobilitets Skift assay (EMSA)7, DNase I fodaftryk8, overflade-Plasmon resonans (spr)9, og sydvestlige blotting 10. disse er dog, lav-gennemløb metoder kun gælder for at undersøge et lille antal DNA-sekvenser. Desuden er præcisionen og følsomheden af nogle af disse teknikker (f. eks. EMSA) lav. På den anden side, in vitro udvælgelse11 er en teknik, der, på samme måde som PBM, kan bruges til identifikation af talrige bindende sekvenser. Men, lav affinitet sekvenser er normalt udelukket i de fleste anvendelser af in vitro udvælgelse; Derfor er denne fremgangsmåde ikke egnet til at opnå sammenlignelige bindings data for alle tilgængelige sekvenser. Den universelle PBM1,2 bruges primært til at karakterisere de bindende karakteristika af transkriptionsfaktorer fra prokaryoter og eukaryoter samt specifikke faktorer (f. eks. tilstedeværelsen af visse ligands, cofaktorer osv.), der kan påvirke denne interaktion12.
HTPP udvider PBM-applikationen til DNA-forarbejdnings enzymer ved at kombinere hidtil uset statistisk effekt med høj gennemløb med høj præcision for at give oplysninger om bindings sekvens konteksten. Sådanne data er endnu ikke opnået for primases og relaterede enzymer (der har svag/forbigående binding til DNA) på grund af førnævnte tekniske begrænsninger af andre tilgængelige teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den PBM metode har været meget anvendt til at undersøge bindende egenskaber af transkriptionsfaktorer og kan også anvendes til DNA-behandling enzymer, såsom DNA primase, der binder sig til DNA med lav affinitet. Der kræves dog visse ændringer af forsøgsprocedurerne. Mikroarray eksperimentet involverer flere trin: design af DNA-biblioteket, forberedelse af chippen, binding af protein målet, fluorescerende mærkning og scanning. Milde vaske trin er kritiske, da de lange skylninger med opløsninger, der indeholder r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Israels VIDENSKABS fond (Grant nr. 1023/18).
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
References
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
