Riconoscimento della sequenza del DNA da parte del primase del DNA utilizzando la profilazione primasise ad alto valore a più velocità
Summary
Gli esperimenti di microarray di legame proteico (PBM) combinati con saggi biochimici collegano le proprietà di legame e catalitiche del primasico del DNA, un enzima che sintetizza i primer dell’RNA sul DNA del modello. Questo metodo, designato come profilazione dei primasi ad alto consumo (HTPP), può essere utilizzato per rivelare modelli di legame del DNA di una varietà di enzimi.
Abstract
I sinteti del DNA sintetizzano brevi primer di RNA che avviano la sintesi del DNA di frammenti di Okazaki sul filamento in ritardo dalla polimerasi del DNA durante la replicazione del DNA. Il legame di primati prokaryotic come DnaG al DNA avviene in una specifica sequenza di riconoscimento trinucleotide. È un passo fondamentale nella formazione dei frammenti di Okazaki. Gli strumenti biochimici convenzionali che vengono utilizzati per determinare la sequenza di riconoscimento del DNA del primato del DNA forniscono solo informazioni limitate. Utilizzando un saggio di legame ad alto consumo basato su microarray e analisi biochimiche consecutive, è stato dimostrato che 1) il contesto di legame specifico (sequenze di fianco del sito di riconoscimento) influenza la forza di legame del DNA primase al suo modello DNA, e 2) un legame più forte dei primati al DNA produce primer di RNA più lunghi, indicando una maggiore proiettività dell’enzima. Questo metodo combina PBM e analisi dell’attività di primasia ed è designato come profilatura del primato ad alta velocità (HTPP) e consente la caratterizzazione del riconoscimento di sequenza specifica da parte del primato del DNA in tempi e scalabilità senza precedenti.
Introduction
HTPP utilizza la tecnologia di microarray di legame del DNA combinata con l’analisi biochimica (Figura 1) per identificare statisticamente caratteristiche specifiche dei modelli di DNA che influenzano l’attività enzimatica del primato del DNA. Pertanto, HTPP fornisce una piattaforma tecnologica che facilita un salto di conoscenza nel campo. Gli strumenti classici utilizzati per determinare i siti di riconoscimento primase non hanno la capacità di produrre enormi quantità di dati, mentre HTPP lo fa.
PBM è una tecnica abitualmente utilizzata per determinare le preferenze di legame dei fattori di trascrizione al DNA1,2; tuttavia, non è adatto per il rilevamento di un legame debole/transitorio delle proteine al DNA. A differenza del PBM universale che fornisce informazioni sulla specificità media di legame delle proteine a tutte le possibili sequenze costituite da otto coppie di basi, HTPP si basa sulla libreria di modelli di DNA a filamento singolo che comprendono elementi di sequenza unici. Tali elementi della sequenza del DNA coinvolgono decine di migliaia di brevi (poche decine di bp), così come sequenze di DNA progettate computazionalmente arricchite in alcuni elementi della sequenza ripetitiva del DNA presenti nel genoma, che possiedono diversi contenuti GC medi . Un approccio ad alta velocità consente la determinazione, in modo sistematico, quantitativo e basato sull’ipotesi, delle proprietà correlate alla sequenza che sono importanti per l’associazione primasite e la sua attività ezimatica3 . In particolare, è stato identificato l’importante legame tra le preferenze di legame primase-DNA (modulato da sequenze di DNA che fiancheggiano specifici siti di legame trinucleotide) e la processiesi primasipera per questo sistema enzimatico4.
La nuova tecnologia è stata applicata per rivedere la nostra comprensione dei siti di riconoscimento dei primati anche per il primato del DNA T7 che è stato ampiamente studiato5. In particolare, il riesame di concetti classici, come i siti di riconoscimento del DNA del DNA T7 primase (che sono stati determinati quasi quattro decenni fa 6) utilizzando il microarray legante proteina-DNA (PBM) ha portato a una comprensione senza precedenti delle caratteristiche relative la sequenza di fianco di questi siti di riconoscimento3. Ci si aspettava che le sequenze che fiancheggiano il sito di riconoscimento tri-nucleotide del primato del DNA T7 (5′-GTC-3′) saranno casuali. Invece, abbiamo scoperto che le sequenze di fianco ricche di TG aumentano le probabilità che il DNA T7 sintetizza i primer più lunghi dell’RNA indicando un aumento della processizia.
Altri metodi che possono essere utilizzati per studiare le proprietà di legame del DNA delle proteine in vitro includono l’analisi elettroforica del cambio di mobilità (EMSA)7, DNase I che ingeri8, risonanza del plasmon (SPR)9e blotting Southwestern 10. Si tratta, tuttavia, di metodi a bassa produttività applicabili solo allo studio di un piccolo numero di sequenze di DNA. Inoltre, la precisione e la sensibilità di alcune di queste tecniche (ad esempio, EMSA) è bassa. D’altra parte, la selezione in vitro11 è una tecnica che, analogamente al PBM, può essere utilizzata per l’identificazione di numerose sequenze di rilegatura. Tuttavia, le sequenze di bassa affinità sono solitamente escluse nella maggior parte delle applicazioni di selezione in vitro; pertanto, questo approccio non è adatto per ottenere dati di associazione comparativi per tutte le sequenze disponibili. L’universale PBM1,2 è utilizzato principalmente per caratterizzare le specificità vincolanti dei fattori di trascrizione da procarioti ed eucarioti, nonché fattori specifici (ad esempio, la presenza di alcuni leganti, cofattori, ecc.) che possono influenzano questa interazione12.
HTPP espande l’applicazione PBM agli enzimi di elaborazione del DNA combinando una potenza statistica ad alta velocità senza precedenti con alta precisione per fornire informazioni sul contesto della sequenza di rilegatura. Tali dati non sono ancora stati ottenuti per i primati e gli enzimi correlati (che hanno un legame debole/transitorio al DNA) a causa delle suddette limitazioni tecniche di altre tecniche disponibili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo PBM è stato ampiamente utilizzato per studiare le proprietà di legame dei fattori di trascrizione e può essere applicato anche agli enzimi di elaborazione del DNA, come il primato del DNA, che si legano al DNA con bassa affinità. Tuttavia, sono necessarie alcune modifiche delle procedure sperimentali. L’esperimento di microarray prevede diversi passaggi: progettazione della libreria del DNA, preparazione del chip, legame del bersaglio proteico, etichettatura fluorescente e scansione. Le lievi fasi di lavagg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalla ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (concessione n. 1023/18).
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
References
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
