Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak
Summary
Protein bağlayıcı mikrodizi (PBM) deneyleri biyokimyasal tahlillerle birleşince, şablon DNA üzerinde RNA astarlarını sentezleyen bir enzim olan DNA primazının bağlayıcı ve katalitik özelliklerini birbirine bağlar. Yüksek iş itrifli primase profilleme (HTPP) olarak tanımlanan bu yöntem, çeşitli enzimlerin DNA bağlayıcı desenlerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Abstract
DNA primazı, DNA replikasyonu sırasında DNA polimeraz tarafından gecikmeli iplikçikteki Okazaki parçalarının DNA sentezini başlatan kısa RNA astarları sentezler. Prokaryotik DnaG benzeri primazların DNA’ya bağlanması belirli bir trinükleotid tanıma dizisinde gerçekleşir. Okazaki parçalarının oluşumunda önemli bir adımdır. DNA primazlarının DNA tanıma dizilimini belirlemek için kullanılan konvansiyonel biyokimyasal araçlar sadece sınırlı bilgi sağlar. Yüksek iş gücü mikrodizi tabanlı bağlayıcı test ve ardışık biyokimyasal analizler kullanılarak, 1) spesifik bağlayıcı bağlamın (tanıma alanının yan dizileri) DNA primazının şablonuna bağlanma gücünü etkilediği gösterilmiştir. DNA, ve 2) DNA primase daha güçlü bağlanması daha uzun RNA astarları verir, enzimin daha yüksek prosesini gösterir. Bu yöntem PBM ve primaz aktivite testi birleştirir ve yüksek iş itfa primase profilleme (HTPP) olarak belirlenmiş ve dna primaz tarafından benzeri görülmemiş zaman ve ölçeklenebilirlik belirli dizi tanıma karakterizasyonu sağlar.
Introduction
HTPP, DNA primazının enzimatik aktivitesini etkileyen DNA şablonlarının belirli özelliklerini istatistiksel olarak belirlemek için biyokimyasal analizle birlikte DNA bağlayıcı mikrodizi teknolojisini(Şekil 1)kullanır. Bu nedenle HTPP, bu alanda bilgi sıçramasını kolaylaştıran teknolojik bir platform sağlamaktadır. Primaz tanıma sitelerini belirlemek için kullanılan klasik araçlar büyük miktarda veri verme yeteneğine sahip değildir, oysa HTPP bunu yapar.
PBM, transkripsiyon faktörlerinin DNA1,2’yebağlanma tercihlerini belirlemek için rutin olarak kullanılan bir tekniktir; ancak proteinlerin DNA’ya zayıf/geçici bağlanmasının saptanması için uygun değildir. Sekiz baz çiftinden oluşan tüm olası dizilere ortalama protein bağlama özgüllüğü hakkında bilgi sağlayan evrensel PBM’nin aksine, HTPP benzersiz dizi öğelerinden oluşan tek iplikli DNA şablonlarının kitaplığına dayanır. Bu tür DNA dizisi elemanları on binlerce kısa (birkaç on bp) genomik dizinin yanı sıra genomda bulunan ve farklı ortalama GC içeriğine sahip olan bazı DNA tekrarlayan dizi elementlerinde zenginleştirilmiş hesaplamalı olarak tasarlanmış DNA dizilerini içerir. . Böyle bir yüksek iş ilişkisi yaklaşımı, sistematik, nicel ve hipotez odaklı bir şekilde, ilkel bağlama ve enzimatik aktivitesi için önemli olan diziile ilgili özelliklerin belirlenmesine olanak sağlar3. Özellikle, primase-DNA bağlama tercihleri arasındaki önemli bağlantı, (spesifik üç nükleotit bağlama siteleri çevreleyen DNA dizileri tarafından modüle) ve primase prosesivite bu enzimatik sistem için tespit edilmiştir4.
Yeni teknoloji kapsamlı 5çalışılmıştırT7 DNA primase için bile primase tanıma siteleri anlayışımızı yeniden ziyaret etmek için uygulanmıştır. Özellikle, t7 DNA primase DNA tanıma siteleri gibi klasik kavramların yeniden incelenmesi (yaklaşık 40 yıl önce tespit edildi 6) protein-DNA bağlayıcı mikrodizi (PBM) ile ilgili özellikleri daha önce görülmemiş bir anlayış yol açmıştır bu tanıma sitelerinin yan sırası3. T7 DNA primazının (5′-GTC-3′) üç nükleotid tanıma bölgesini çevreleyen sekansların rastgele olması beklenmektedir. Bunun yerine, TG açısından zengin yan dizilerin T7 DNA primazının daha uzun RNA astarlarını sentezleme şansını artırdığını ve proseste bir artış olduğunu gördük.
Proteinlerin DNA bağlayıcı özelliklerini in vitro incelemek için kullanılabilecek diğer yöntemler arasında elektroforetik hareketlilik değişim testi (EMSA)7, DNase I ayak izi8, yüzey plazmon rezonans (SPR)9ve Güneybatı blotting 10. Ancak bunlar, düşük iş verme yöntemleridir, sadece az sayıda DNA dizisinin araştırılması için geçerlidir. Buna ek olarak, bu tekniklerden bazılarının (örneğin, EMSA) hassasiyeti ve hassasiyeti düşüktür. Diğer taraftan, in vitro selection11, PBM’ye benzer şekilde, çok sayıda bağlama dizisinin tanımlanmasında kullanılabilecek bir tekniktir. Ancak, düşük yakınlık dizileri genellikle in vitro seçimi nin çoğu uygulamasında dışlanır; bu nedenle, bu yaklaşım tüm kullanılabilir diziler için karşılaştırmalı bağlama verileri elde etmek için uygun değildir. Evrensel PBM1,2 esas olarak prokaryotlar ve ökaryotlar dan transkripsiyon faktörlerin bağlayıcı özellikleri yanı sıra belirli faktörler (örneğin, bazı ligands varlığı, kofactors, vb) karakterize etmek için kullanılır bu etkileşimi etkiler12.
HTPP, ciltleme sırası bağlamı hakkında bilgi sağlamak için eşi görülmemiş yüksek iş letiye istatistiksel gücü yüksek hassasiyetle birleştirerek PBM uygulamasını DNA işleme enzimlerine genişletir. Bu tür veriler, mevcut diğer tekniklerin yukarıda belirtilen teknik sınırlamaları nedeniyle primases ve ilgili enzimler (DNA’ya zayıf/geçici bağlayıcılığı olan) için henüz elde edilmemiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
PBM yöntemi transkripsiyon faktörlerinin bağlayıcı özelliklerini araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır ve düşük afinite ile DNA’ya bağlanan DNA primazgibi DNA işleme enzimlerine de uygulanabilir. Ancak, deneysel prosedürlerin bazı değişiklikler gereklidir. Mikrodizi deneyi birkaç adım içerir: DNA kütüphanesinin tasarımı, çipin hazırlanması, protein hedefinin bağlanması, floresan etiketleme ve tarama. Deterjan içeren solüsyonlar ile uzun yıkamalar zayıf/geçici bağlanma modu …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma İsRAİl Bİlİm VAKFI (hibe no. 1023/18) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
References
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
