डीएनए द्वारा डीएनए अनुक्रम मान्यता उच्च-Throughput प्राइमाज़ प्रोफ़ेशनल का उपयोग कर
Summary
प्रोटीन बाइंडिंग माइक्रोरेयर (पीबीएम) जैव रासायनिक परख के साथ संयुक्त प्रयोगों डीएनए प्राइमर के बाध्यकारी और उत्प्रेरक गुणों को जोड़ते हैं, एक एंजाइम जो टेम्पलेट डीएनए पर आरएनए प्राइमर को संश्लेषित करता है। इस विधि, उच्च throughput प्राइमाज़ प्रोफाइलिंग (HTPP) के रूप में नामित, एंजाइमों की एक किस्म के डीएनए बाध्यकारी पैटर्न प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
डीएनए प्राइमेज़ कम आरएनए प्राइमर को संश्लेषित करता है जो डीएनए प्रतिकृति के दौरान डीएनए पॉलिमरेज द्वारा पिछड़े किनारा पर ओकाज़ाकी टुकड़े के डीएनए संश्लेषण को आरंभ करता है। डीएनए के लिए प्रोकैरियोटिक डीएनएजी की तरह प्राइमेस की बाइंडिंग एक विशिष्ट trinucleotide मान्यता अनुक्रम में होती है। यह Okazaki टुकड़े के गठन में एक महत्वपूर्ण कदम है. पारंपरिक जैव रासायनिक उपकरण है कि डीएनए primase के डीएनए मान्यता अनुक्रम निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है केवल सीमित जानकारी प्रदान करते हैं. एक उच्च throughput microarray आधारित बाध्यकारी परख और लगातार जैव रासायनिक विश्लेषण का उपयोग करना, यह दिखाया गया है कि 1) विशिष्ट बाध्यकारी संदर्भ (मान्यता साइट के flanking दृश्यों) अपने टेम्पलेट के लिए डीएनए प्राइमाज़ की बाध्यकारी ताकत को प्रभावित करती है डीएनए, और 2) डीएनए के लिए प्राइमेज़ की मजबूत बाध्यकारी अब आरएनए प्राइमर पैदावार, एंजाइम के उच्च processivity का संकेत. इस विधि पीबीएम और प्राइमाज़ गतिविधि परख को जोड़ती है और उच्च के रूप में नामित किया गया है-थ्रूपुट प्राइमाज़ प्रोफाइलिंग (HTPP), और यह अभूतपूर्व समय और मापनीयता में डीएनए primese द्वारा विशिष्ट अनुक्रम मान्यता की विशेषता की अनुमति देता है.
Introduction
एचटीपीपी डीएनए बाइंडिंग माइक्रोरेरे प्रौद्योगिकी का उपयोग जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ संयुक्त करता है (चित्र 1) डीएनए टेम्पलेट्स की विशिष्ट विशेषताओं की सांख्यिकीय रूप से पहचान करने के लिए जो डीएनए प्राइमेज़ की एंजाइमी गतिविधि को प्रभावित करता है। इसलिए, HTPP एक तकनीकी मंच है कि क्षेत्र में एक ज्ञान छलांग की सुविधा प्रदान करता है. प्रथम मान्यता साइटों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले शास्त्रीय उपकरणों में भारी मात्रा में डेटा प्राप्त करने की क्षमता नहीं है, जबकि एचटीपीपी करता है।
पीबीएम एक ऐसी तकनीक है जिसका प्रयोग डीएनए 1,2के प्रतिलेखन कारकों की बाध्यकारी प्राथमिकताओं को निर्धारित करने के लिए नियमित रूप से किया जाता है ; तथापि, यह डीएनए के लिए प्रोटीन के कमजोर/परिवर्तनीय बंधन का पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं है। आठ आधार जोड़े से मिलकर सभी संभव दृश्यों के लिए औसत प्रोटीन बाध्यकारी विशिष्टता के बारे में जानकारी प्रदान करता है कि सार्वभौमिक पीबीएम के विपरीत, HTPP अद्वितीय अनुक्रम तत्वों को शामिल एकल फैला डीएनए टेम्पलेट्स के पुस्तकालय पर आधारित है। इस तरह के डीएनए अनुक्रम तत्वों जीनोम में मौजूद कुछ डीएनए दोहराव अनुक्रम तत्वों में समृद्ध कुछ डीएनए दोहराव अनुक्रम तत्वों में समृद्ध हजारों कम (बीपी के कुछ दसियों) जीनोम दृश्यों, साथ ही साथ computationally डिजाइन डीएनए दृश्यों के दसियों शामिल है, जो विभिन्न औसत जीसी सामग्री के अधिकारी . इस तरह के एक उच्च throughput दृष्टिकोण के निर्धारण की अनुमति देता है, एक व्यवस्थित, मात्रात्मक, और परिकल्पना संचालित तरीके से, अनुक्रम से संबंधित गुण है कि प्राइमे बंधन और इसकी एंजाइमी गतिविधि3के लिए महत्वपूर्ण हैं. विशेष रूप से, प्राइमेज़-डीएनए बाइंडिंग प्राथमिकताओं के बीच महत्वपूर्ण लिंक, (विशिष्ट त्रि-न्यूक्लिओटाइड बाइंडिंग साइटों के बगल में डीएनए दृश्यों द्वारा संशोधित) और इस एंजाइमी प्रणाली4के लिए प्राइमेज़ प्रोसेक्टिविटी की पहचान की गई है।
नई प्रौद्योगिकी टी7 डीएनए प्राइमासे के लिए भी प्राइमेसी मान्यता स्थलों के बारे में हमारी समझ पर फिर से विचार करने के लिए लागू की गई थी , जिसका व्यापक अध्ययन किया गया है5. विशेष रूप से, शास्त्रीय अवधारणाओं की फिर से जांच, जैसे T7 डीएनए प्राइमाज़ के डीएनए मान्यता साइटों (जो लगभग चार दशक पहले निर्धारित किया गया था 6) प्रोटीन-डीएनए बाध्यकारी microarray (PBM) का उपयोग कर से संबंधित सुविधाओं में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया गया है इन मान्यता स्थलों के flanking अनुक्रम3. यह उम्मीद की गई थी कि टी 7 डीएनए प्राइमेज़ (5′-जीटीसी-3′) की त्रि-न्यूक्लिओटाइड मान्यता साइट के बगल में अनुक्रम यादृच्छिक होंगे। इसके बजाय, हमने पाया कि टीजी समृद्ध flanking दृश्यों T7 डीएनए primese की संभावना को बढ़ाने के लिए अब आरएनए प्राइमर संश्लेषित processivity में वृद्धि का संकेत.
अन्य तरीकों कि इन विट्रो में प्रोटीन के डीएनए बाध्यकारी गुणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA)7, DNase मैं पदचिह्न8, सतह-प्लासम अनुनाद (एसपीआर)9, और दक्षिण पश्चिमी blotting शामिल 10.तथापि, ये कम-थ्रूपुट विधियां हैं जो केवल डीएनए अनुक्रमों की एक छोटी संख्या की जांच करने के लिए लागू होती हैं. इसके अलावा, इन तकनीकों में से कुछ की सटीक और संवेदनशीलता (उदा., EMSA) कम है. दूसरी ओर, इन विट्रो चयन11 एक तकनीक है कि, इसी तरह पीबीएम के लिए, कई बाध्यकारी दृश्यों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, कम आत्मीयता दृश्यों आमतौर पर इन विट्रो चयन के अधिकांश अनुप्रयोगों में बाहर रखा गया है; इसलिए, यह उपागम सभी उपलब्ध अनुक्रमों के लिए तुलनात्मक बाइंडिंग डेटा प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है। सार्वभौमिक पीबीएम1,2 का उपयोग मुख्य रूप से प्रोकैरियोट और यूकैरियोट से प्रतिलेखन कारकों की बाध्यकारी विशिष्टताओं के साथ-साथ विशिष्ट कारकों (जैसे, कुछ लिगन्ड्स की उपस्थिति, सहकारक, आदि) की विशेषता के लिए किया जाता है जो हो सकता है इस बातचीत को प्रभावित12|
HTPP बाध्यकारी अनुक्रम संदर्भ पर जानकारी प्रदान करने के लिए उच्च परिशुद्धता के साथ अभूतपूर्व उच्च throughput सांख्यिकीय शक्ति के संयोजन के द्वारा डीएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के लिए पीबीएम आवेदन का विस्तार। अन्य उपलब्ध तकनीकों की उपर्युक्त तकनीकी सीमाओं के कारण ऐसे आंकड़े अभी तक प्राइमेसिस और संबंधित एंजाइमों (जो डीएनए के लिए कमजोर/परिवर्तनीय बाध्यकारी हैं) के लिए प्राप्त नहीं किए गए हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
पीबीएम विधि व्यापक रूप से प्रतिलेखन कारकों के बाध्यकारी गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और यह भी डीएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे डीएनए प्राइमेज़, कि कम आत्मीय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को इसराल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 1023/
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
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| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
References
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