DNA Sequence anerkjennelse av DNA Primase ved hjelp av høy gjennomstrømming Primase profilering
Summary
Microarray (PBM) eksperimenter kombinert med biokjemiske analyser knytter de bindende og katalysatorer til DNA-primase, et enzym som syntetiserer RNA-primere på mal-DNA. Denne metoden, utpekt som høy gjennomstrømming primase profilering (HTPP), kan brukes til å avdekke DNA-bindende mønstre av en rekke enzymer.
Abstract
DNA primase syntetiserer kort RNA primere som starter DNA-syntese av Okazaki fragmenter på henger strand av DNA polymerase under DNA-replikering. Bindingen av prokaryote DnaG-lignende primases til DNA oppstår ved en bestemt trinucleotide anerkjennelse sekvens. Det er et vesentlig skritt i dannelsen av Okazaki fragmenter. Konvensjonelle biokjemiske verktøy som brukes til å bestemme DNA-anerkjennelse sekvensen av DNA-primase gir bare begrenset informasjon. Ved hjelp av en Microarray bindings analyse med høy gjennomstrømming og påfølgende biokjemiske analyser, har det vist seg at 1) den spesifikke bindings konteksten (flankerer sekvenser av anerkjennelses stedet) påvirker bindings styrken til DNA-primase til dens mal DNA, og 2) sterkere binding av primase til DNA gir lengre RNA-primere, noe som indikerer høyere processivity av enzymet. Denne metoden kombinerer PBM og primase aktivitet analysen og er utpekt som høy gjennomstrømming primase profilering (HTPP), og det tillater karakterisering av spesifikke sekvens anerkjennelse av DNA primase i enestående tid og skalerbarhet.
Introduction
HTPP gjør bruk av DNA bindende Microarray teknologi kombinert med biokjemiske analyse (figur 1) for å statistisk identifisere bestemte funksjoner i DNA-maler som påvirker enzymatisk aktivitet av DNA-primase. Derfor gir HTPP en teknologisk plattform som forenkler et kunnskaps sprang i felten. Den klassiske verktøy som brukes til å bestemme primase anerkjennelse nettsteder ikke har muligheten til å gi enorme mengder data, mens HTPP gjør.
PBM er en teknikk som rutinemessig brukes til å bestemme bindende preferanser av transkripsjon faktorer til DNA1,2; Det er imidlertid ikke egnet for påvisning av svake/forbigående binding av proteiner til DNA. I motsetning til den universelle PBM som gir informasjon om gjennomsnittlig protein bindende spesifisitet til alle mulige sekvenser bestående av åtte base parene, HTPP er basert på biblioteket av single-strandet DNA maler bestående av unike sekvens elementer. Slike DNA sekvens elementer innebære titusenvis kort (noen titalls BP) genomisk sekvenser, samt beregningsmessig utformet DNA-sekvenser beriket i visse DNA repeterende sekvens elementer til stede i Genova, som besitter ulike gjennomsnittlige GC innhold . En slik høy gjennomstrømmings tilnærming gjør det mulig å bestemme, på en systematisk, kvantitativ og hypotese-drevet måte, de sekvens relaterte egenskapene som er viktige for primase binding og dets enzymatisk aktivitet3. Spesielt den viktige koblingen mellom primase-DNA bindende preferanser, (modulert av DNA-sekvenser flankerer spesifikke Tri-nukleotid bindende områder) og primase processivity har blitt identifisert for dette enzymatisk system4.
Den nye teknologien ble brukt for å revidere vår forståelse av primase anerkjennelse nettsteder selv for T7 DNA primase som har blitt grundig studert5. Nærmere bestemt, re-undersøkelse av klassiske konsepter, slik som DNA-anerkjennelse nettsteder av T7 DNA primase (som ble bestemt nesten fire ti år siden 6) ved hjelp av PROTEIN-DNA bindende MICROARRAY (PBM) har ført til enestående innsikt i funksjoner knyttet til flankerer sekvensen av disse anerkjennelse nettsteder3. Det var forventet at sekvensene flankerer Tri-nukleotid anerkjennelse stedet av T7 DNA primase (5 ‘-GTC-3 ‘) vil være tilfeldig. I stedet fant vi at TG-rike flankerer sekvenser øker sjansene for T7 DNA-primase til å syntetisere lengre RNA-primere som indikerer en økning i processivity.
Andre metoder som kan brukes til å studere DNA-bindende egenskaper av proteiner in vitro inkluderer Elektroforetiske mobilitet Shift-analysen (EMSA)7, DNase jeg Footprinting8, overflate-Plasmon resonans (spr)9, og Southwestern blotting 10. disse er imidlertid lav gjennomstrømming metoder bare gjelder for å undersøke et lite antall DNA-sekvenser. I tillegg er presisjonen og følsomheten til noen av disse teknikkene (f. eks EMSA) lav. På den annen side, in vitro utvalg11 er en teknikk som, på samme måte som PBM, kan brukes til identifisering av mange bindende sekvenser. Imidlertid, lav affinitet sekvenser er vanligvis utelukket i de fleste anvendelser av in vitro valg; Denne tilnærmingen er derfor ikke egnet for innhenting av komparative bindings data for alle tilgjengelige sekvenser. Den universelle PBM1,2 er i hovedsak brukt til å karakterisere bindingen særegenheter av transkripsjon faktorer fra prokaryoter og Landplantenes samt spesifikke faktorer (for eksempel tilstedeværelsen av visse ligander, kofaktorer, etc.) som kan påvirke denne samhandlingen12.
HTPP utvider PBM programmet til DNA prosessering enzymer ved å kombinere enestående høy gjennomstrømming statistisk effekt med høy presisjon for å gi informasjon om bindende sekvens sammenheng. Slike data er ennå ikke innhentet for primases og beslektede enzymer (som har svake/forbigående binding til DNA) på grunn av nevnte tekniske begrensninger for andre tilgjengelige teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den PBM metoden har vært mye brukt til å undersøke bindende egenskaper transkripsjon faktorer og kan også brukes til DNA prosessering enzymer, slik som DNA primase, som binder til DNA med lav affinitet. Imidlertid er visse modifikasjoner av eksperimentelle prosedyrer nødvendig. Den Microarray eksperimentet omfatter flere trinn: design av DNA-biblioteket, utarbeidelse av chip, binding av proteinet målet, fluorescerende merking, og skanning. Milde vasketrinn er avgjørende, siden den lange vasker med løsninger som i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av ISRAELS VITENSKAPS STIFTELSE (Grant no. 1023/18).
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
References
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
