DNA-sekvens erkännande av DNA-Primase med hög genomströmning Primase profilering
Summary
Proteinbindnings metoder för microarray (PBM) kombinerat med biokemiska analyser binder samman de bindande och katalytiska egenskaperna hos DNA-Primase, ett enzym som syntetiserar RNA-primers på mallDNA. Denna metod, som betecknas som hög genomströmning Primase profilering (HTPP), kan användas för att avslöja DNA-bindande mönster av en mängd olika enzymer.
Abstract
DNA-Primase syntetiserar korta RNA-primrar som initierar DNA-syntes av Okazaki fragment på släpar strand med DNA-polymeras under DNA-replikering. Bindningen av prokaryota DnaG-liknande primaser till DNA sker vid en specifik trinukleotid erkännande sekvens. Det är ett avgörande steg i bildandet av Okazaki fragment. Konventionella biokemiska verktyg som används för att bestämma DNA-igenkänningssekvens av DNA-Primase ger endast begränsad information. Med hjälp av ett mikromatrisbaserat bindnings test med hög kapacitet och konsekutiva biokemiska analyser har det visats att 1) den specifika bindnings kontexten (flanka sekvenser av tolknings platsen) påverkar DNA-priminas bindningsstyrka till dess mall DNA, och 2) starkare bindning av Primase till DNA ger längre RNA-primers, vilket indikerar högre processivitet av enzymet. Denna metod kombinerar PBM och Primase Activity assay och betecknas som High-throughput Primase profilering (HTPP), och det gör karakterisering av specifika sekvens erkännande av DNA-Primase i oöverträffad tid och skalbarhet.
Introduction
HTPP använder sig av DNA-bindande Mikroarrayteknik kombinerat med biokemisk analys (figur 1) för att statistiskt identifiera specifika egenskaper hos DNA-mallar som påverkar den enzymatiska AKTIVITETEN hos DNA-Primase. Därför erbjuder HTPP en teknologisk plattform som underlättar ett kunskaps språng på fältet. De klassiska verktyg som används för att bestämma Primase erkännande platser inte har förmågan att ge massiv mängd data, medan HTPP gör.
PBM är en teknik som rutinmässigt används för att bestämma bindnings preferenserna för transkriptionsfaktorerna till DNA1,2; emellertid, det är inte lämpligt för detektion av svag/övergående bindning av proteiner till DNA. Till skillnad från Universal PBM som ger information om genomsnittlig proteinbindnings noggrannhet till alla möjliga sekvenser bestående av åtta bas par, är HTPP baserad på biblioteket av enkelsträngade DNA-mallar som består av unika sekvens element. Sådana DNA-sekvens element innebär tiotusentals korta (några tiotals BP) genomiska sekvenser, samt beräkningsmässigt utformade DNA-sekvenser berikats i vissa DNA repetitiva sekvens element som finns i genomet, som besitter olika genomsnittliga GC innehåll . En sådan hög genomströmning tillvägagångssätt möjliggör bestämning av, på ett systematiskt, kvantitativt och hypotes-driven sätt, sekvens-relaterade egenskaper som är viktiga för Primase bindning och dess enzymatisk aktivitet3. I synnerhet har den viktiga kopplingen mellan Primase-DNA-bindande preferenser (modulerad med DNA-sekvenser som kantas av specifika Tri-nukleotidbindnings ställen) och primasprocessivitet identifierats för detta enzymatiska system4.
Den nya tekniken tillämpades för att åter besöka vår förståelse av Primase erkännande platser även för T7 DNA Primase som har studerats utförligt5. Specifikt, förnyad undersökning av klassiska begrepp, såsom DNA-erkännande platser av T7 DNA Primase (som bestämdes nästan fyra decennier sedan 6) med hjälp av protein-DNA-bindning microarray (PBM) har lett till oöverträffad insikt i funktioner relaterade till den kompletterande sekvens av dessa erkännande platser3. Det förväntades att sekvenserna flanera Tri-nukleotid erkännande plats av T7 DNA Primase (5 ‘-GTC-3 ‘) kommer att vara slumpmässigt. Istället fann vi att TG-rika kompletterande sekvenser öka chanserna för T7 DNA Primase att syntetisera längre RNA-primers indikerar en ökning av processivitet.
Andra metoder som kan användas för att studera DNA-bindande egenskaper hos proteiner in vitro inkluderar den elektroforetiska Mobility Shift-analysen (EMSA)7, DNase I fotavtryck8, Surface-Plasmon resonans (SPR)9, och sydvästra blotting 10. dessa är dock låg genomflöde metoder endast tillämpas för att undersöka ett litet antal DNA-sekvenser. Dessutom är precisionen och känsligheten hos vissa av dessa tekniker (t. ex. EMSA) låg. Å andra sidan, in vitro-val11 är en teknik som, på samma sätt som PBM, kan användas för identifiering av många bindnings sekvenser. Låg affinitet sekvenser är dock oftast uteslutna i de flesta tillämpningar av in vitro-val; den här metoden lämpar sig därför inte för att erhålla jämförande bindnings data för alla tillgängliga sekvenser. Universal PBM1,2 används främst för att karakterisera de bindande särdragen hos transkriptionsfaktorerna från prokaryoter och Eukaryoter samt specifika faktorer (t. ex. förekomst av vissa ligander, kofaktorer etc.) som kan påverka denna interaktion12.
HTPP utökar PBM-programmet till DNA-bearbetningsenzymer genom att kombinera oöverträffad statistisk kraft med hög kapacitet med hög precision för att ge information om bindningssekvenskontext. Sådana uppgifter har ännu inte erhållits för primaser och relaterade enzymer (som har svag/övergående bindning till DNA) på grund av ovannämnda tekniska begränsningar för andra tillgängliga tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
PBM-metoden har ofta använts för att undersöka bindningsegenskaper hos transkriptionsfaktorer och kan även appliceras på DNA-bearbetningsenzymer, såsom DNA-Primase, som binder till DNA med låg affinitet. Emellertid, vissa ändringar av experimentella förfaranden krävs. Microarray experimentet omfattar flera steg: design av DNA-biblioteket, beredning av chip, bindning av proteinet målet, fluorescerande märkning, och skanning. Milda tvättsteg är kritiska, eftersom de långa tvättar med lösningar som innehål…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant nr 1023/18).
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
References
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
