ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות
Summary
כאן אנו מציגים מערכת התרבות הvivo לשעבר מעורב מעורבת לחקר התא glioma האדם (hGC) הגירה בזמן אמת. מודל זה מספק את היכולת להתבונן באינטראקציות בין השמאל לבין האקטונים המייאלואידית והלא-מיאלואידית בתוך תא מחולק.
Abstract
גלינובלסטומה הוא אחד מסוגי הסרטן האנושיים האגרסיביים ביותר בשל הטרוגניות הסלולר הנרחבת ומאפייני ההגירה של ההההההבין. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הגירה של תאים glioma, היכולת ללמוד את האינטראקציה בין האקולונס לבין אקסונים בתוך סביבת מיקרו הגידול היא חיונית. כדי לדגמן את האינטראקציה התאית הזאת, פיתחנו מערכת תרבות מעורבת המורכבת מ-“האוליגודנדרוציטים” ושיתוף התרבויות השורש (DRG). תרבויות DRG נבחרו כי הם יכולים להיות מבודדים ביעילות יכול ליצור את התחזיות ארוך, נרחב אשר אידיאליים ללימודי הגירה של הטבע הזה. Oligodendrocytes הפוך עכברוש מטוהרים הוספו לאחר מכן על מטוהרים מטוהר drg אקסונים והמושרה מיאלואידית. לאחר המאשרת את היווצרות של מיאלין קומפקטי, האזורית הוספו לבסוף לתרבות המשותף והאינטראקציות שלהם עם ה-drg אקסונים ו oligodendrocytes הפוך היה תחת פיקוח בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ הזמן לשגות. תחת התנאים הללו, הגנוזה טופס מבנים צבירה כמו לבטא gfap ו Ki67, להעביר לאורך שניהם שירים מיאלואידית ושאינם מיאלואידית ולקיים אינטראקציה עם סיבי אלה באמצעות היווצרות פסבדו. מערכת שיתוף התרבות vivo שלנו לשעבר ניתן להשתמש כדי לזהות מנגנונים סלולריים ומולקולריים של הרומן של hGC הגירה והוא עלול לשמש עבור בדיקות יעילות התרופה מחוץ גופית.
Introduction
גלינובלסטומה הוא אחד הגידולים האגרסיביים והקטלניים ביותר של המוח האנושי. התקן הנוכחי של טיפול כולל כריתת כירורגית של הגידול ואחריו קרינה1 בתוספת במקביל ומינהל הפסיקה של temozolomide2. אפילו עם גישה זו רב טיפולית, הישנות הגידול הוא בלתי נמנע3. זה בחלקו בשל הטבע הנדידה נרחב של תאי הגידול, אשר לפלוש המוח בתוך מתעליה ביצירת אצבעות מרובות כמו התחזיות במוח4 כי לבצע כריתה מלאה סביר.
בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור כי התוקפנות של gliנובלסטומה היא בשל, בין השאר, לנוכחות של אוכלוסייה של תאי גזע סרטן בתוך מסת הגידול5,6, אשר מוצג פוטנציאל נדידה גבוהה7,8, עמידות כימותרפיה וקרינה9,10 ואת היכולת טופס גידולים משניים11. GSCs מסוגלים ללכוד גידולים פוליבטיים המקורי כאשר xenografted ושתל עכברים עירום5.
למרות העושר של הידע לגבי הרקע הגנטי של glioblastomas, המחקרים על הגירה תא glioma (GC) מפריע כיום על ידי חוסר יעיל בתחום החוץ או במודלים הגירה vivo. במיוחד, בעוד האינטראקציות של התאים glioma cell מאופנן על ידי גורמים סלולריים וסביבתיים הם רכיב ליבה של הפלישה glioma, לידע שלנו אין כיום מערכת ניסיונית עם היכולת לדגמן אלה אינטראקציות12,13,14. כדי להתמודד עם מחסור זה, פיתחנו מערכת התרבות vivo ex של האזורית שיתוף תרבותי עם מטוהרים DRG axon-oligodendrocytes הפוך כי התוצאה ביטוי מוגבר של סמני הגידול הבדיל, כמו גם הגירה נרחבת אינטראקציה של ההאנון עם סיבים מיאלואידית ולא מיאלואידית. זו פלטפורמה vivo ex, בשל הפריסה ממדר שלה, מתאים לבדיקת ההשפעות של הרומן therapeutics על דפוסי הגירה hGC.,
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן לבצע לימודי הגירה בתחום באמצעות מערכות קאמרית של Boyden או שריטות. עם זאת, בעוד ניסויים אלה להיכשל לתת כל מידע על האינטראקציות של תאים סרטניים עם רקמות אחרות שמסביב, המערכת הנוכחית יכולה ללכוד אינטראקציות GC עם סיבים מיאלואידית ולא מיאלואידית. יתר על כן, כדי ללמוד היווצרות הגידול והגירה נ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי קרנות פנימיות של המחלקה לנוירוכירורגיה, אוניברסיטת בראון כדי N.T.
Materials
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. . Glioblastoma. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
