Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme
Summary
Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC’ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.
Abstract
Glioblastom, yoğun hücresel heterojenlik ve hGC’lerin göç özellikleri nedeniyle en agresif insan kanserlerinden biridir. Glioma hücre göçünaltında yatan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için tümör mikroortamında hGC’ler ve aksonlar arasındaki etkileşimi inceleme yeteneği esastır. Bu hücresel etkileşimi modellemek için hGC’ler ve dorsal kök gangliyonu (DRG) akson-oligodendrocyte ortak kültürlerden oluşan karma bir kültür sistemi geliştirdik. DRG kültürleri, verimli bir şekilde izole edilebildikleri ve bu tür göç çalışmaları için ideal olan uzun ve kapsamlı projeksiyonları oluşturabildikleri için seçilmiştir. Saflaştırılmış sıçan oligodendrocytes sonra saflaştırılmış sıçan DRG aksonlar eklendi ve miyelin indüklenen. Kompakt miyelin oluşumunu doğruladıktan sonra, hGC’ler nihayet co-kültüre eklendi ve DRG akson ve oligodendrositler ile etkileşimleri zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. Bu koşullar altında, HGC’ler GFAP ve Ki67’yi ifade eden tümör benzeri agrega yapıları oluştururlar, hem miyelinli hem de miyelinsiz aksonal izler boyunca göç eder ve psödopodi oluşumu yoluyla bu aksonlarla etkileşime girilir. Ex vivo co-kültür sistemimiz hGC göçünün yeni hücresel ve moleküler mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir ve potansiyel olarak in vitro ilaç etkinliği testi için kullanılabilir.
Introduction
Glioblastom insan beyninin en agresif ve ölümcül tümörlerinden biridir. Mevcut bakım standardı, tümörün cerrahi rezeksiyonu ve ardından radyasyon1 artı eşlik eden ve temozolomide2’ninadjuvan uygulamasıdır. Bu multi-terapötik yaklaşım la bile, tümör nüks kaçınılmazdır3. Bu kısmen tümör hücrelerinin geniş göç doğası nedeniyle, beyin parankim istila beyin içinde birden fazla parmak benzeri projeksiyonlar oluşturarak4 tam rezeksiyon olası hale.
Son yıllarda, bu glioblastoma saldırganlık nedeniyle olduğu ortaya çıkmıştır, kısmen, tümör kitle içinde kanser kök hücrelerinin bir popülasyonvarlığı nabağlı5,6, yüksek göç potansiyeli sergileyen7,8, kemoterapi ve radyasyona direnç9,10 ve ikincil tümörler oluşturmak için yeteneği11. GSC’ler çıplak farelere xenografted zaman orijinal poliklonal tümörler recapitulating yeteneğine sahiptir5.
Glioblastomların genetik geçmişi ile ilgili bilgi zenginliğine rağmen, glioma hücreli (GC) göçü üzerine yapılan çalışmalar şu anda etkin in vitro veya in vivo göç modellerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Özellikle, glioma hücre-aksonal etkileşimleri hücresel ve çevresel faktörler tarafından modüle glioma invazyonunun temel bileşeni olmakla birlikte, bizim bilgimize göre şu anda bu etkileşimleri modelleme yeteneği ile hiçbir deneysel sistem yoktur12,13,14. Bu eksikliği gidermek için, farklılaştırılmış tümör belirteçlerinin yüksek ekspresyonunun yanı sıra hGC’lerin miyelinatlı ve miyelinatlı olmayan liflerle etkileşiminin yanı sıra, saflaştırılmış DRG akson-oligodendrositlerle birlikte kültürlenen primer hGC’lerden oluşan bir ex vivo kültür sistemi geliştirdik. Bu ex vivo platformu, bölümlere ayrılmış düzeni nedeniyle, hGC göç desenleri üzerinde yeni terapötik etkilerini test etmek için uygundur.,
Protocol
Representative Results
Discussion
HGC’ler için göç çalışmaları Boyden oda sistemleri veya çizik tahlilleri kullanılarak yapılabilir. Ancak, bu deneyler diğer çevre dokuları ile tümör hücrelerinin etkileşimleri ile ilgili herhangi bir bilgi vermek için başarısız olsa da, mevcut sistem miyelinatlı ve non-miyelinated lifleri ile GC etkileşimleri özetleyebilir. Ayrıca, tümör oluşumu ve son nokta göç çalışma, kemirgen beyin veya kemirgen beyin veya kanadı içine glioma hücrelerinin in vivo implantasyon organotipik dilim kül…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Brown Üniversitesi’nden N.T.’ye nöroşirürji bölümü dahili fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. . Glioblastoma. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
