Mærkning af blodkar i Teleost hjernen og hypofysen ved hjælp af kardiel perfusion med en DiI-fixative
Summary
Artiklen beskriver en hurtig protokol til mærkning blodkar i en teleost fisk ved hjerte perfusion af DiI fortyndet i fikseringsmiddel, ved hjælp af medaka (Oryzias latipes) som model og med fokus på hjernen og hypofyse væv.
Abstract
Blodkar innerverer alle væv i hvirveldyr, så deres overlevelse ved at give de nødvendige næringsstoffer, ilt, og hormonelle signaler. Det er et af de første organer til at begynde at fungere under udvikling. Mekanismer af blodkar dannelse er blevet et emne af høj videnskabelig og klinisk interesse. Hos voksne er det imidlertid vanskeligt at visualisere Vaskulaturen i de fleste levende dyr på grund af deres lokalisering dybt inde i andre væv. Ikke desto mindre, visualisering af blodkar er stadig vigtigt for flere undersøgelser såsom endokrinologi og Neurobiologi. Mens flere transgene linjer er blevet udviklet i zebrafish, med blodkar direkte visualiseret gennem udtryk af fluorescerende proteiner, findes der ikke sådanne værktøjer til andre teleost arter. Ved hjælp af medaka (oryzias latipes) som model, den nuværende protokol præsenterer en hurtig og direkte teknik til at mærke blodkar i hjernen og hypofysen ved perfusing gennem hjertet med fiksativ indeholder DiI. Denne protokol giver mulighed for forbedring af vores forståelse af, hvordan hjernen og hypofyse celler interagerer med blod vaskulatur i hele væv eller tykke vævs skiver.
Introduction
Blodkarrene spiller en væsentlig rolle i hvirveldyr, da de giver de nødvendige næringsstoffer, ilt og hormonelle signaler til alle organer. Også, da opdagelsen af deres involvering i kræft udvikling1, har de fået megen opmærksomhed i klinisk forskning. Selv om en række publikationer har undersøgt de mekanismer, der tillader blodkar vækst og morfogenese, og et stort antal gener er vigtige for deres dannelse er blevet identificeret2, en masse mangler at blive forstået med hensyn til samspillet mellem celler eller væv og cirkulerende blod.
Visualisering af blod vaskulatur i hjernen og hypofysen er vigtig. Neuroner i hjernen kræver en høj tilførsel af ilt og glucose3, og hypofysen indeholder op til otte vigtige hormon-producerende celletyper, der bruger blodgennemstrømningen til at modtage signal fra hjernen og sende deres respektive hormoner til forskellige perifert organ4,5. Mens der i pattedyr, portalsystemet i bunden af hypothalamus navngivet median eminence, forbinder hjernen og hypofysen6, sådan en klar blod bro er ikke blevet beskrevet i teleost fisk. Faktisk, i teleosts, preoptico-hypothalamus neuroner direkte projekt deres axoner i pars nervosa af hypofysen7 og for det meste innerverer de forskellige endokrine celletyper direkte8,9. Men, nogle af disse neuroner har deres nerveender placeret i det ekstravaskulære rum, i umiddelbar nærhed af blod kapillærer10. Derfor er forskellen mellem teleost fisk og pattedyr ikke så klar, og forholdet mellem blod Vaskulaturen og hjernen og hypofyse celler kræver større undersøgelse i teleost fisk.
Zebrafish har i mange henseender et anatomisk og funktionelt sammenligneligt vaskulære system til andre hvirveldyr arter11. Det er blevet en kraftfuld hvirveldyr model for kardiovaskulær forskning mest takket være udviklingen af flere transgene linjer, hvor komponenterne i det vaskulære system er mærket med fluorescerende reporter proteiner12. Men, nøjagtige kredsløbssygdomme anatomi kan variere mellem arter, eller endda mellem to individer, der tilhører den samme art. Derfor, visualisering af blodkar kan være af stor interesse også i andre teleost arter, som gensplejsning værktøjer ikke eksisterer.
Flere teknikker er blevet beskrevet for at mærke blodkarrene i både pattedyr og teleoster. Disse omfatter in situ-hybridisering for vaskulatur-specifikke gener, alkalisk fosfatasefarvning, mikroangiografi og farve indsprøjtninger (til en gennemgang Se13). Fluorescerende lipofile kationiske indocarbocyanine Dye (DiI) blev først brugt til at studere membran lipider lateral mobilitet, da det er bevaret i lipid dobbeltlag og kan migrere gennem det14,15,16. Faktisk et molekyle af DiI er sammensat af to kulbrinte kæder og chromophores. Mens kulbrinte kæderne integreres i lipid-bilags cellemembranen i cellerne i kontakt med den, forbliver chromophorerne på dens overflade17. Når i membranen, DiI molekyler diffuse sideværts inden for lipid tolags som hjælper til at plette membran strukturer, der ikke er i direkte kontakt med den DiI løsning. Indsprøjtning en DiI opløsning gennem hjerte perfusion, vil derfor mærke alle endotel celler i kontakt med den sammensatte, der tillader direkte mærkning af blodkarrene. I dag DiI bruges også til andre farvning formål, såsom enkelt molekyle billeddannelse, skæbne kortlægning, og neuronal sporing. Interessant, flere fluorophores eksisterer (med forskellige bølgelængder af emission) tillader kombinationen med andre fluorescerende etiketter, og inkorporering samt den laterale diffusion af DiI kan forekomme i både levende og faste væv18, 19. det er
Formaldehyd, som blev opdaget af Ferdinand Blum i 1893, har været anvendt bredt i dag som det foretrukne kemikalie til vævs fiksering20,21. Det viser bred specificitet for de fleste cellulære mål og bevarer cellulære struktur22,23. Det bevarer også de fluorescerende egenskaber af de fleste fluorophores, og dermed kan anvendes til fikse transgene dyr, for hvilke målrettede celler udtrykke fluorescerende reporter proteiner.
I dette manuskript er en tidligere protokol udviklet til at mærke blodkarrene i små eksperimentelle pattedyrs modeller24 er blevet tilpasset til brug i fisk. Hele proceduren tager kun et par timer at udføre. Det viser, hvordan man kan perfuse en fikativ opløsning af formaldehyd, der indeholder DiI i fiskens hjerte for direkte at mærke alle blodkar i hjernen og hypofysen af modellen fisk medaka. Medaka er en lille ferskvandsfisk indfødte til Asien, primært findes i Japan. Det er en forskning model organisme med en række molekylære og genetiske værktøjer til rådighed25. Derfor, identifikation af blodkar i denne art samt i andre vil gøre det muligt at forbedre vores forståelse af, hvordan hjernen og hypofyse celler interagerer med blod vaskulatur i hele væv eller tykke væv skiver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hjerte perfusion med DiI tidligere har været brugt til at mærke blodkar i flere model arter24, herunder teleost fisk13.
Som DiI er direkte leveret til endotel cellemembranen ved perfusion i Vaskulaturen, er det muligt at øge signal-til-støj forholdet ved at øge DiI koncentrationen i fiksativ løsning. Derudover giver fluorophore intens farvning, når den er spændt med minimal blegning, hvilket giver relativt langvarig emission<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Shinji Kanda for demonstration af kardiel perfusion med fikativ opløsning i medaka, Lourdes Carreon G Tan for hjælp med medaka-opdræt og Anthony Peltier til illustrationer. Dette arbejde blev finansieret af NMBU og af Forskningsrådet i Norge, tilskud nummer 248828 (Digital Life Norge program).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. . Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
