Märkning av blod kärl i teleost hjärnan och hypofysen använda hjärt per fusion med en DiI-fixativ
Summary
I artikeln beskrivs ett snabbt protokoll för märkning blod kärl i en Benfisk fisk genom hjärt per fusion av DiI utspädd i fixativ, med hjälp av medaka (oryzias Auktor) som modell och med fokus på hjärna och hypofys vävnad.
Abstract
Blod kärlen innerverar alla vävnader i ryggradsdjur, vilket möjliggör deras överlevnad genom att tillhandahålla nödvändiga näringsämnen, syre och hormonella signaler. Det är en av de första organen att börja fungera under utvecklingen. Mekanismerna för bildandet av blod kärl har blivit föremål för ett högt vetenskapligt och kliniskt intresse. Hos vuxna är det dock svårt att visualisera kärl i de flesta levande djur på grund av deras lokalisering djupt inom andra vävnader. Ändå är visualisering av blod kärl viktigt för flera studier såsom endokrinologi och neurobiologi. Medan flera transgena linjer har utvecklats i zebra fisk, med blod kärl direkt visualiseras genom uttryck av fluorescerande proteiner, inga sådana verktyg finns för andra Benfisk arter. Med hjälp av medaka (oryzias Auktor) som modell, det nuvarande protokollet presenterar en snabb och direkt teknik för att märka blod kärl i hjärnan och hypofysen genom att parfymera genom hjärtat med fixativ som innehåller DiI. Detta protokoll gör det möjligt att förbättra vår förståelse för hur hjärnan och hypofysen celler interagerar med blod kärl i hela vävnad eller tjocka vävnad skivor.
Introduction
Blod kärlen spelar en viktig del av ryggradsdjur eftersom de ger nödvändiga näringsämnen, syre och hormonella signaler till alla organ. Dessutom, eftersom upptäckten av deras inblandning i cancer utveckling1, de har fått mycket uppmärksamhet i klinisk forskning. Även om ett antal publikationer har undersökt de mekanismer som möjliggör blod kärlens tillväxt och morfogenes, och ett stort antal gener viktiga för deras bildning har identifierats2, återstår mycket att förstå om samspelet mellan celler eller vävnader och det cirkulerande blodet.
Visualisering av blod kärl i hjärnan och hypofysen är viktigt. Nerv celler i hjärnan kräver en hög tillförsel av syre och glukos3, och hypofysen innehåller upp till åtta viktiga hormonproducerande cell typer som använder blod flödet för att ta emot signal från hjärnan och skicka sina respektive hormoner till olika perifera organ4,5. Även i däggdjur, Portal systemet vid basen av hypotalamus som heter median eminens, länkar hjärnan och hypofysen6, en sådan tydlig blod bro har inte beskrivits i Benfisk fisk. I själva verket, i teleosts, preoptico-hypotalamus nerv celler direkt projicera sina axoner i pars nervosa av hypofysen7 och mesta dels innerverar de olika endokrina cell typer direkt8,9. Emellertid, några av dessa nerv celler har sina nerv ändar ligger i extravaskulär rymden, i nära närhet till blod kapillärer10. Därför är skillnaden mellan Benfisk fisk och däggdjur inte så tydlig, och förhållandet mellan blod kärl och hjärnan och hypofysen celler kräver större utredning i Benfisk fisk.
Zebrafish har i många avseenden ett anatomiskt och funktionellt jämförbart kärl system till andra ryggradsdjur11. Det har blivit en kraftfull ryggradsdjur modell för kardiovaskulär forskning främst tack vare utvecklingen av flera transgena linjer där komponenter i det vaskulära systemet är märkta med fluorescerande reporter proteiner12. Emellertid, exakt cirkulations systemet anatomi kan variera mellan arter, eller till och med mellan två individer som tillhör samma art. Därför kan visualisering av blod kärl vara av stort intresse även i andra Benfisk arter för vilka genmodifiering verktyg inte existerar.
Flera tekniker har beskrivits för att märka blod kärlen i både däggdjur och teleoster. Dessa inkluderar in situ hybridisering för vasculature-specifika gener, alkaliska fosfataser färgning, mikroangiografi, och färg ämnen injektioner (för en översyn se13). Fluorescerande lipofila katjoniska indocarbocyanine Dye (DiI) användes först för att studera membran lipider lateral rörlighet som det bevaras i lipidbilayers och kan migrera genom det14,15,16. Faktum är att en molekyl av DiI består av två kolvätekedjor och kromophores. Medan kolvätekedjorna integreras i lipidbilayer cell membranet i cellerna i kontakt med den, kromophores kvar på sin yta17. En gång i membranet, DiI molekyler diffusa i sidled inom Lipiden lipidens som hjälper till att färga membran strukturer som inte är i direkt kontakt med DiI lösningen. Injicera en DiI lösning genom hjärt per fusion, kommer därför att märka alla endotelceller i kontakt med föreningen möjliggör direkt märkning av blod kärlen. Idag DiI används också för andra färgning ändamål, såsom enstaka molekyl avbildning, öde kart läggning, och neuronala spårning. Intressant, flera fluorophores finns (med olika våg längder av utsläpp) så att kombinationen med andra fluorescerande etiketter, och införlivandet samt den laterala diffusion av DiI kan förekomma i både levande och fasta vävnader18, och 19.
Formaldehyd, upptäcktes av Ferdinand Blum i 1893, har använts i stor utsträckning till nutid som den föredragna kemikalie för vävnadsfixering20,21. Den visar en bred specificitet för de flesta cellulära mål och bevarar den cellulära strukturen22,23. Det bevarar också de fluorescerande egenskaperna hos de flesta fluorophores, och kan därför användas för att fixera transgena djur för vilka riktade celler uttrycker fluorescerande reporter proteiner.
I detta manuskript, ett tidigare protokoll som utvecklats för att märka blod kärl i små experimentella däggdjurs modeller24 har anpassats till användningen i fisk. Hela proceduren tar bara några timmar att utföra. Det visar hur man kan parfymera en fixativ lösning av formaldehyd som innehåller DiI i fisken hjärtat för att direkt märka alla blod kärl i hjärnan och hypofysen av modellen fisk medaka. Medaka är en liten sötvatten fisk hemma i Asien, främst i Japan. Det är en forskningsmodellorganism med en svit av molekyl ära och genetiska verktyg tillgängliga25. Därför, identifiering av blod kärl i denna art samt i andra kommer att göra det möjligt att förbättra vår förståelse för hur hjärnan och hypofysen celler interagerar med blod kärl i hela vävnad eller tjocka vävnad skivor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hjärt per fusion med DiI tidigare har använts för att märka blod kärl i flera modell arter24, inklusive Benfisk fisk13.
Som DiI levereras direkt till endotelceller cell membranet genom per fusion i vasculature, är det möjligt att öka signal-brus-förhållandet genom att öka DiI koncentrationen i fixativ lösning. Dessutom ger fluorophore intensiv färgning när upphetsad med minimal blekning möjliggör relativt långvariga ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Shinji Kanda för demonstration av hjärt per fusion med fixativ lösning i medaka, MS Lourdes Carreon G Tan för hjälp med medaka djur hållning, och Mr Anthony Peltier för illustrationer. Detta arbete finansierades av NMBU och av Norges forsknings råd, stipendium nummer 248828 (Digital Life Norge-programmet).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. . Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
