In Vivo Immunofluorescence Localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer
Summary
La méthode de localisation de l’immunofluorescence in vivo (IVIL) peut être utilisée pour examiner la biodistribution in vivo d’anticorps et d’anticorps conjugués à des fins oncologiques chez des organismes vivants à l’aide d’une combinaison de ciblage tumoral in vivo et d’immunostaining ex vivo Méthodes.
Abstract
Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des outils importants dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer. Ils sont utilisés pour démêler le rôle des protéines dans la tumorigénèse, peuvent être dirigés vers les biomarqueurs du cancer permettant la détection et la caractérisation des tumeurs, et peuvent être utilisés pour la thérapie contre le cancer comme mAbs ou des conjugués anticorps-médicaments pour activer les cellules effectrices immunitaires, pour inhiber voies de signalisation, ou tuer directement les cellules porteuses de l’antigène spécifique. En dépit des progrès cliniques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être altérées par la complexité et l’hétérogénéité du microenvironnement de tumeur. Ainsi, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d’anticorps, il est crucial d’évaluer la biodistribution et l’interaction du conjugué à base d’anticorps avec le microenvironnement tumoral vivant. Ici, nous décrivons In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) comme une nouvelle approche pour étudier les interactions des thérapies et des diagnostics basés sur les anticorps dans les conditions physiologiques et pathologiques in vivo. Dans cette technique, un anticorps thérapeutique ou diagnostique d’antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo et localisé ex vivo avec un anticorps secondaire dans les tumeurs isolées. IVIL reflète donc la biodistribution in vivo de médicaments à base d’anticorps et d’agents de ciblage. Deux applications IVIL sont décrites évaluant la biodistribution et l’accessibilité des agents de contraste basés sur les anticorps pour l’imagerie moléculaire du cancer du sein. Ce protocole permettra aux futurs utilisateurs d’adapter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.
Introduction
Les anticorps monoclonaux (mAb) sont de grandes glycoprotéines (environ 150 kDa) de la superfamille d’immunoglobuline qui sont sécrétées par les cellules B et ont une fonction primaire dans le système immunitaire pour identifier et inhiber la fonction biologique de, ou marquer pour pathogènes bactériens ou viraux, et peuvent reconnaître l’expression protéique anormale sur les cellules cancéreuses1. Les anticorps peuvent avoir une affinité extrêmement élevée avec leurs épitopes spécifiques jusqu’aux concentrations femtomolaires, ce qui en fait des outils très prometteurs en biomédecine2. Avec le développement de la technologie hybridome par Milstein et Kohler (prix Nobel en 1984), la production de mAbs est devenu possible3. Plus tard, mAbs humains ont été générés en utilisant la technologie d’affichage de phage ou souches transgéniques de souris et ont révolutionné leur utilisation comme outils de recherche et thérapeutiquesnouvelles 4,5.
Le cancer est un problème de santé mondial et une cause majeure de décès, créant la nécessité de nouvelles approches pour la prévention, la détection et la thérapie6. Jusqu’ici, les mAbs ont permis l’extraction du rôle des gènes et de leurs protéines dans la tumorigénèse et une fois dirigécontre des biomarqueurs de cancer, peut permettre la détection et la caractérisation de tumeur pour la stratification patiente. Pour la thérapie de cancer, les mAbs bispécifiques, les conjugués anticorps-médicaments, et de plus petits fragments d’anticorps sont développés comme thérapeutiques, et pour l’administration ciblée de drogue pour augmenter l’efficacité thérapeutique7. En outre, les anticorps servent pour le ciblage de biomarqueurs des agents de contraste pour des modalités d’imagerie moléculaire telles que la chirurgie fluorescence-guidée, l’imagerie photoacoustique (PA), l’imagerie moléculaire d’ultrason (US), et l’émission médicalement employée de positron tomographie (PET) ou tomographie calculée par émission de photons (SPECT)8. Enfin, les anticorps peuvent également être utilisés comme agents théranostiques permettant la stratification des patients et la surveillance de la réponse pour les thérapies ciblées9. Par conséquent, les nouveaux mAbs commencent à jouer un rôle critique dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer.
En dépit des progrès critiques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être rendues inefficaces en raison de la complexité de l’environnement de tumeur. Les interactions entre anticorps dépendent du type d’épitopée, c’est-à-dire qu’il soit linéaire ou conformationnel10. En plus de la reconnaissance des antigènes, les anticorps doivent surmonter les barrières naturelles telles que les parois des vaisseaux, les membranes basales et le stroma tumoral pour atteindre les cellules cibles exprimant l’antigène. Les anticorps interagissent avec le tissu non seulement à travers le domaine de liaison d’antigène à fragment variable (Fab), mais aussi à travers le fragment cristallin constant (Fc) qui conduit à des interactions hors site11. Le ciblage est également compliqué par l’expression hétérogène des marqueurs de tumeur tout au long du volume de tumeur et de l’hétérogénéité dans la vascularisation de tumeur et le système lymphatique12,13. En outre, le microenvironnement de tumeur est composé des fibroblastes cancer-associés qui soutiennent des cellules de tumeur, des cellules immunitaires de tumeur qui suppriment des réactions immunitaires antitumorales, et de l’endothélium de tumeur qui soutient le transport de l’oxygène et des éléments nutritifs, tous des qui interfèrent avec la pénétration, la distribution et la disponibilité de thérapies ou de diagnostics à base d’anticorps. Dans l’ensemble, ces considérations peuvent limiter l’efficacité thérapeutique ou diagnostique, réduire la réponse au traitement, et peut entraîner une résistance tumorale.
Par conséquent, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d’anticorps, il est crucial d’évaluer la biodistribution et l’interaction de la conjugaison à base d’anticorps dans le microenvironnement tumoral. Actuellement, dans les études précliniques, l’expression de marqueur dans les modèles de recherche de tumeur est analysée ex vivo par la coloration d’immunofluorescence (IF) des sections de tumeur14. La coloration standard de SI est exécutée avec les anticorps marqueurs-spécifiques primaires qui sont alors accentués par les anticorps fluorescents secondaires sur des tranches de tissu de tumeur ex vivo qui ont été isolées de l’animal. Cette technique met en évidence l’emplacement statique du marqueur au moment de la fixation du tissu et ne donne pas un aperçu de la façon dont les traitements ou les diagnostics à base d’anticorps pourraient se répartir ou interagir dans des conditions physiologiques. L’imagerie moléculaire par PET, SPECT, US, et PA peut fournir des informations sur la distribution d’agent de contraste conjugué par anticorps dans les modèles précliniques vivants8,15. Comme ces modalités d’imagerie ne sont pas invasives, des études longitudinales peuvent être effectuées et des données sensibles au temps peuvent être recueillies avec un nombre minimal d’animaux par groupe. Cependant, ces approches d’imagerie moléculaire non invasives ne sont pas assez sensibles et n’ont pas une résolution suffisante pour la localisation de la distribution des anticorps au niveau cellulaire. En outre, les caractéristiques physiques et biologiques de l’anticorps primaire peuvent être radicalement modifiées par la conjugaison d’un agent de contraste16.
Afin de prendre en considération les conditions physiologiques et pathologiques in vivo de la façon dont les thérapies et les diagnostics à base d’anticorps interagissent dans l’environnement tumoral et d’obtenir une distribution cellulaire et même sous-cellulaire à haute résolution profils des anticorps non conjugués, nous proposons une approche de IF, réputée localisation d’immunofluorescence in vivo (IVIL), dans laquelle l’anticorps antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo. Le thérapeutique ou le diagnostic à base d’anticorps, agissant comme un anticorps primaire, circule dans les vaisseaux sanguins fonctionnels et se lie à sa protéine cible dans le cadre tumoral très précis et vivant. Après l’isolement des tumeurs in vivo-étiquetées avec l’anticorps primaire, un anticorps secondaire est employé pour localiser les conjugués accumulés et retenus d’anticorps. Cette approche est similaire à une approche d’histologie DE LA SI précédemment décrite injectant des anticorps étiquetés fluorescents17. Bien qu’ici, l’utilisation d’anticorps non conjugués évite un changement potentiel dans les caractéristiques de biodistribution induites par la modification des anticorps. En outre, l’application ex vivo d’anticorps secondaires fluorescents évite une perte possible du signal de fluorescence pendant la collecte et le traitement des tissus et fournit l’amplification de l’intensité du signal de fluorescence. Notre approche d’étiquetage reflète la biodistribution in vivo de médicaments à base d’anticorps et d’agents ciblés et peut fournir des informations importantes pour le développement de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques.
Ici, nous décrivons deux applications de la méthode IVIL appliquées dans des études précédentes portant sur la biodistribution et l’accessibilité des agents de contraste à base d’anticorps pour les approches d’imagerie moléculaire pour la détection du cancer du sein. Tout d’abord, la biodistribution d’un colorant infrarouge proche de l’anticorps (anticorps-B7-H3 liés au colorant de fluorescence infrarouge proche, vert endocyanine, B7-H3-ICG) et l’agent de contrôle de l’isotype (Iso-ICG) pour la fluorescence et la photoacoustique moléculaire l’imagerie est explorée18. La méthode de cette application est décrite dans le protocole. Ensuite, les résultats de biodistribution d’un anticorps conformationnellement sensible à la netrin-1, généralement non détectable avec l’imagerie FI traditionnelle, utilisé avec l’imagerie moléculaire par ultrasons, est quantifié et présenté dans les résultats représentatifs19. À la fin de ce document de protocole, les lecteurs devraient se sentir à l’aise d’adopter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode comporte plusieurs étapes critiques et nécessite des modifications potentielles pour assurer une mise en œuvre réussie. Tout d’abord, la posologie et le moment de l’injection intraveineuse d’anticorps/anticorps conjugués doivent être adaptés à l’application spécifique. En général, des doses doivent être utilisées qui sont compatibles avec la façon dont le conjugaison d’anticorps sera généralement utilisé, c’est-à-dire, des doses assorties de l’anticorps thérapeutique ou de l’agent de con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) pour les discussions et l’utilisation de l’équipement. Nous remercions le Dr Juergen K. Willmann pour son mentorat. Cette étude a été appuyée par la subvention du NIH R21EB022214 (KEW), la subvention de formation NIH R25CA118681 (KEW) et le NIH K99EB023279 (KEW). Le Stanford Neuroscience Microscopy Service a été soutenu par NIH NS069375.
Materials
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
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