Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu
Summary
In vivo immünfloresans lokalizasyonu (IVIL) yöntemi, in vivo tümör hedeflemesi ve ekzo immünboyama kombinasyonu nu kullanarak canlı organizmalarda onkolojik amaçlarla antikor ve antikor konjugatörlerinin in vivo biyodağılımını incelemek için kullanılabilir. Yöntemler.
Abstract
Monoklonal antikorlar (mAbs) kanser teşhisi, tanısı ve tedavisinde önemli araçlardır. Onlar tümörigenez proteinlerin rolünü çözmek için kullanılır, tümör tespiti ve karakterizasyonu sağlayan kanser biyobelirteçleri yönlendirilebilir, ve mAbs veya antikor-ilaç conjugates olarak kanser tedavisi için kullanılabilir bağışıklık etkileyici hücreleri etkinleştirmek için, inhibe etmek sinyal yolları, ya da doğrudan belirli antijen taşıyan hücreleri öldürmek. Yeni ve son derece spesifik mGe’lerin geliştirilmesi ve üretimindeki klinik gelişmelere rağmen, tanı ve tedavi uygulamaları tümör mikroortamının karmaşıklığı ve heterojenliği ile bozulabilir. Bu nedenle, etkili antikor bazlı tedaviler ve tanıların geliştirilmesi için, antikor bazlı konjuge’nin canlı tümör mikroortamı ile biyodağılımı ve etkileşiminin değerlendirilmesi çok önemlidir. Burada In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) in vivo fizyolojik ve patolojik koşullarda antikor bazlı terapötik ve tanı etkileşimlerini incelemek için yeni bir yaklaşım olarak tanımlıyoruz. Bu teknikte, terapötik veya tanısal antijene özgü antikor intravenöz olarak invivo ve lokalize ex vivo izole tümörlerde ikincil antikor ile enjekte edilir. Bu nedenle IVIL, antikor bazlı ilaçların ve hedefleme ajanlarının in vivo biyodağılımını yansıtmaktadır. İki IVIL uygulaması meme kanserinin moleküler görüntülemesi için antikor bazlı kontrast ajanların biyodağılımı ve erişilebilirliğini değerlendirirken tanımlanmıştır. Bu protokol, gelecekteki kullanıcıların IVIL yöntemini kendi antikor tabanlı araştırma uygulamaları için uyarlamalarına olanak sağlayacaktır.
Introduction
Monoklonal antikorlar (mAb) b hücreleri tarafından salgılanan ve bağışıklık sisteminde biyolojik işlevini belirlemek ve inhibe etmek için birincil bir fonksiyona sahip immünglobulin süper familyasının büyük glikoproteinleridir (yaklaşık 150 kDa) yıkım, bakteriyel veya viral patojenler, ve kanser hücrelerinde anormal protein ekspresyonu tanıyabilir1. Antikorlar femtomolar konsantrasyonları onları biyotıp2son derece umut verici araçlar yapma kendi özel epitopsiçin son derece yüksek bir yakınlık olabilir. Milstein ve Köhler tarafından hibridoma teknolojisinin gelişmesiile (1984 yılında Nobel Ödülü) ile mAbs üretimi mümkün oldu3. Daha sonra, insan mAbs faj ekran teknolojisi veya transgenik fare suşları kullanılarak oluşturulan ve yeni araştırma araçları ve terapötik4,5olarak kullanım devrim .
Kanser dünya çapında bir sağlık sorunu ve önleme, algılama vetedavi6 için yeni yaklaşımlar için ihtiyaç yaratarak ölüm önemli bir nedenidir. Bugüne kadar, mAbs tümörigenez genlerin rolü ve proteinlerin extrication izin verdi ve kanser biyobelirteçleri karşı yönlendirildiğinde, hasta tabakalaşma için tümör tespiti ve karakterizasyonu sağlayabilir. Kanser tedavisi için, bispesifik mAbs, antikor-ilaç konjugeler, ve küçük antikor parçaları terapötik olarak geliştirilmektedir, ve terapötiketkinliğiniartırmak için hedeflenen ilaç teslim imiş 7 . Buna ek olarak, antikorlar floresan güdümlü cerrahi, fotoakustik (PA) görüntüleme, ultrason (ABD) moleküler görüntüleme ve klinik olarak kullanılan pozitron emisyonu gibi moleküler görüntüleme yöntemleri için kontrast ajanların biyomarker hedeflemeiçin hizmet tomografi (PET) veya tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT)8. Son olarak, antikorlar da hedeflenen tedaviler için hastaların tabakalaşma ve yanıt izleme sağlayan teranostik ajanlar olarak kullanılabilir9. Bu nedenle, yeni mAbs kanser tespiti, tanı ve tedavisinde kritik bir rol oynamaya başlıyor.
Yeni ve son derece spesifik mGe’lerin geliştirilmesi ve üretimindeki kritik gelişmelere rağmen, tanı ve tedavi uygulamaları tümör ortamının karmaşıklığı nedeniyle etkisiz hale getirilebilir. Antikor etkileşimleri epitop türüne bağlıdır,yani,doğrusal veya konformasyonel10olup olmadığını. Antijenlerin tanınmasına ek olarak, antikorlar damar duvarları gibi doğal engelleri aşmak gerekir, bazal membranlar, ve tümör stroma antijen ifade hedef hücrelere ulaşmak için. Antikorlar doku ile sadece değişken parça antijen bağlama (Fab) etki alanı yoluyla değil, aynı zamanda sabit kristal in parçası (Fc) ile etkileşime hangi daha da off-site etkileşimleri yol açar11. Tümör vaskülarizasyonunda tümör toplu ve heterojenlik ve lenfatik sistemde tümör belirteçlerinin heterojen ekspresyonu ile de hedefleme karmaşıktır12,13. Buna ek olarak, tümör mikroçevre tümör hücrelerini destekleyen kanser ilişkili fibroblastlar oluşur, anti-tümör bağışıklık reaksiyonları bastırmak tümör bağışıklık hücreleri, ve oksijen ve besin naklini destekleyen tümör endotel, tüm antikor bazlı terapötik lerin veya tanıların penetrasyonunu, dağılımını ve kullanılabilirliğini engelleyen. Genel olarak, bu hususlar terapötik veya tanısal etkinliği sınırlayabilir, tedavi yanıtını azaltabilir ve tümör direncine neden olabilir.
Bu nedenle, etkili antikor tabanlı tedaviler ve tanı ların geliştirilmesi için, tümör mikroortamında antikor bazlı konjuge biyodağılımı ve etkileşiminin değerlendirilmesi çok önemlidir. Şu anda klinik öncesi çalışmalarda tümör araştırma modellerinde belirteç ekspresyonu, tümörkesitlerininimmünoresans (IF) boyaması ile ex vivo olarak analiz edilir. Standart IF boyama, hayvandan izole edilmiş ekstrem tümör doku dilimlerinde sekonder floresan etiketli antikorlar ile vurgulanan primer marker spesifik antikorlarla yapılır. Bu teknik, doku fiksasyonu sırasında belirteç statik konumunu vurgular ve antikor tabanlı terapötik veya tanı fizyolojik koşullarda dağıtmak veya etkileşim nasıl içgörü sağlamaz. PET, SPECT, ABD ve PA tarafından moleküler görüntüleme yaşayan preklinik modellerde antikor konjuge kontrast madde dağılımı hakkında bilgi sağlayabilir8,15. Bu görüntüleme yöntemleri non-invaziv olduğundan, boylamsal çalışmalar yapılabilir ve zamana duyarlı veriler grup başına en az sayıda hayvan ile toplanabilir. Ancak, bu non-invaziv moleküler görüntüleme yaklaşımları yeterince duyarlı değildir ve hücresel düzeyde antikor dağılımının lokalizasyonu için yeterli çözünürlüğe sahip değildir. Ayrıca, birincil antikor fiziksel ve biyolojik özellikleri büyük ölçüde bir kontrast madde16konjugasyonu ile değiştirilebilir.
İn vivo fizyolojik ve patolojik durumları göz önünde bulundurarak antikor bazlı terapötik ve tanıların tümör ortamında nasıl etkileştiğini göz önünde bulundurmak ve yüksek çözünürlüklü hücresel ve hatta hücre altı dağılım elde etmek için konjuge olmayan antikor profilleri, antijene özgü antikorin intravenöz olarak intravenöz olarak intravenöz olarak enjekte edildiği Vivo İmmünofloresan Lokalizasyonunda (IVIL) kabul edilen bir IF yaklaşımı öneriyoruz. Antikor bazlı terapötik veya tanısal, birincil antikor olarak hareket, fonksiyonel kan damarlarında dolaşır ve son derece doğru, yaşayan tümör ortamında hedef protein bağlanır. İn vivo etiketli tümörlerin primer antikorile izole edilmesinden sonra, birikmiş ve korunmuş antikor konjugatörlerinin lokalize edilmesi nde ikincil bir antikor kullanılır. Bu yaklaşım, floresan olarak etiketlenmiş antikorenjekte eden if histoloji yaklaşımına daha önce tanımlanmış bir yaklaşıma benzer17. Burada ise, konjuge olmayan antikorların kullanımı antikor modifikasyonu ile indüklenen biyodağıtım özelliklerinde potansiyel bir değişiklik önler. Ayrıca floresan sekonder antikorların ex vivo uygulaması doku toplama ve işleme sırasında olası bir floresan sinyali kaybını önler ve floresan sinyal yoğunluğunun arttırılmasını sağlar. Etiketleme yaklaşımımız antikor bazlı ilaçların ve hedefli ajanların canlı biyodağılımını yansıtır ve yeni tanı ve tedavi edici ajanların gelişimi için önemli bilgiler sağlayabilir.
Burada, meme kanseri saptanması için moleküler görüntüleme yaklaşımları için antikor bazlı kontrast ajanların biyodağılımı nı ve erişilebilirliğini araştıran önceki çalışmalarda uygulandığı gibi IVIL yönteminin iki uygulamasını açıklıyoruz. İlk olarak, bir antikor-yakın kızılötesi boya konjuge biyodağılımı (anti-B7-H3 antikor yakın kızılötesi floresan boya bağlı, indosiyane yeşili, B7-H3-ICG) ve izotip kontrol ajanı (Iso-ICG) floresan ve fotoakustik moleküler moleküler için görüntüleme18araştırılır. Bu uygulamanın yöntemi protokolde açıklanmıştır. Daha sonra, netrin-1 bir konformasyonel duyarlı antikor biyodağıtım sonuçları, genellikle geleneksel IF görüntüleme ile tespit edilemez, ultrason moleküler görüntüleme ile kullanılan, sayısallaştırılmış ve temsili sonuçlarda sunulan19. Bu protokol makalesinin sonunda, okuyucular kendi antikor tabanlı araştırma uygulamaları için IVIL yöntemini benimseyerek rahat hissetmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem birkaç kritik adıma sahiptir ve başarılı bir uygulama sağlamak için olası değişiklikler gerektirir. İlk olarak, antikor/antikor konjuge intravenöz enjeksiyonun dozajı ve zamanlaması özel uygulamaya uygun olmalıdır. Genellikle, dozlar antikor konjuge genellikle nasıl kullanılacağı ile tutarlı kullanılmalıdır, yani, terapötik antikor veya antikor tabanlı kontrast ajan eşleşen dozlarda. Ayrıca, hedef dokuların toplanmasının zamanlaması dikkatle düşünülmelidir. Antikorlar ve a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Andrew Olson’a (Stanford Neuroscience Mikroskopi Servisi) tartışmalar ve ekipman kullanımı için teşekkür ederiz. Dr. Juergen K. Willmann’a akıl hocalığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R21EB022214 hibe (KEW), NIH R25CA118681 eğitim hibe (KEW) ve NIH K99EB023279 (KEW) tarafından desteklenmiştir. Stanford Nörobilim Mikroskopi Servisi NIH NS069375 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
