בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.
Abstract
המעי הוא הבית למספר הגדול ביותר של תאים חיסוניים בגוף. המעי קטן וגדול מערכת חיסונית המשטרה חשיפה לאנטיגנים אקסוגני ולווסת את התגובות החזק מיקרוביואלי החיסון הנגזרות. מסיבה זו, המעי הוא אתר היעד העיקרי של חוסר תקנה חיסונית ודלקת במחלות רבות, כולל אבל, לא מוגבל למחלות מעיים דלקתיות כגון מחלת קרוהן כיבית קוליטיס, השתל-מול-מארח מחלה (GVHD) לאחר העצם השתלת מח עצם (BMT), ומצבים אלרגיים וזיהומיות רבים. מודלים murine של דלקת במערכת העיכול ו קוליטיס משמשים בכבדות כדי לחקור סיבוכים GI ו-קלינית מיטוב אסטרטגיות למניעה וטיפול. נתונים שנאסף מן המודלים האלה באמצעות בידוד וניתוח פנוטימית של תאים חיסוניים מן המעי הוא קריטי כדי הבנה חיסונית נוספת שניתן להחיל על מערכת העיכול שפר הפרעות דלקתיות מערכתית. דו ח זה מתאר פרוטוקול אפקטיבי ביותר לבידוד של תאים מוננועיים (MNC) מהמעי הגס באמצעות ממשק מעבר הדרגתי מעורב בדחיסות מבוססת סיליקה. שיטה זו בונה מבודד מספר משמעותי של לוקיציטים קיימא תוך מזעור פסולת מזהם, ומאפשר פנוטיפים החיסונית הבאים על ידי הזרימה cy, try או שיטות אחרות.
Introduction
למרות מערכת העיכול (GI) במערכת מוקדש בעיקר עיבוד וספיגה חוזרת של חומרים מזינים מזון, במערכת GI גם שומר על תפקידים מרכזיים ביושרה של כלי הדם, הלימפה, והעצבים של איברים רבים אחרים באמצעות המערכת החיסונית שלה submucosal1. מערכת החיסון GI יש תפקיד רב השפעה הן בריאות המערכת העיכול ומערכתית בשל החשיפה המתמדת שלו אנטיגנים זרים ממזון, בקטריה של הקומנדנט, או פולשים פתוגנים1,2. לכן, מערכת החיסון GI חייב לשמור על איזון עדין שבו היא סובלנית אנטיגנים שאינם פתוגניים תוך התגובה בהתאם אנטיגנים פתוגניים1,2. כאשר האיזון של סובלנות והגנה מופרת, מקומי או מערכתית החיסונית חוסר תקנה ודלקת יכול להתרחש כתוצאה מספר עצום של מחלות1,2,3.
המעי נמלים לפחות 70% של כל תאי הלימפה בגוף4. האינטראקציות הראשוניות ביותר במערכת החיסונית כרוכות לפחות באחת משלוש תחנות החיסון במעי: 1. כתמים של Peyer, 2) לימפוציטים האפיתל (אל-על) ו-3) לימפוציטים באופן מרכזי (LPL). כל אלה מורכב רשת מורכבת מחוברים של תאים חיסוניים המגיבים במהירות לאתגרים החיסונית נורמלי בבטן5. מוגבל לסטרומה מעל המוסקולריס mucosae, מובנה לאמינה מובנית היא רקמת החיבור של רירית הבטן וכולל פיגומים על הוויאוס, הוזוקולטורה, ניקוז הלימפה, מערכת העצבים mucosae, כמו גם מולדים רבים ומערכת המשנה החיסונית. האדפטיבית6,7,8,9 LPL הם מורכבים CD4+ ו CD8+ T תאים ביחס משוער של 2:1, תאים פלזמה ותאים השושלת המייאלואידית כולל, תאים דנדריטים, התורן תאים, אאוזיפרפילים ו מקרופאגים6.
יש עניין הולך וגובר בהבנת הדיסתקנה החיסונית ודלקת הבטן כפי שהיא מתייחסת למצבי מחלה שונים. תנאים כגון מחלת קרוהן ו קוליטיס כיבית כל מניפסט רמות שונות של דלקת במעי הגס10,11,12. בנוסף, חולים עם הפרעות ממאירות או שאינן ממאירות של מח או מערכת החיסון אשר עוברים השתלת מח עצם allogeneic (allo-BMT) יכול לפתח צורות שונות של קוליטיס כולל 1) רעילות ישירה מתוך התניה משטרי לפני bmt, 2) זיהומים נגרמת על ידי דיכוי חיסוני לאחר bmt ו 3) השתל-מול-מארח מחלה (gvhd) מונע על ידי מסוג התורם תאים T מגיב התורם allo-אנטיגנים ברקמות לאחר bmt13,14,15. כל אלה post-bmt סיבוכים לגרום שינויים משמעותיים בסביבה החיסונית של המעיים16,17,18. השיטה המוצעת מאפשרת הערכה מהימנה של הצטברות תאים חיסוניים במעי הגס של העכבר, כאשר מוחל על הנמענים murine לאחר BMT, מקלה על היכולת היעילה של שני התאים החיסוניים של התורם והנמען המעורבים סובלנות השתלה19 ,20. גורמים נוספים לדלקות בטן כוללים ממאירות, אלרגיה למזון, או שיבוש מיקרובידום המעיים. פרוטוקול זה מאפשר גישה של תאים מונוליניים המעיים מן המעי הגס, עם שינויים, לוקיציטים של המעי הדק בכל אחד מדגמי murine אלה טרום קלינית.
חיפוש בתוך באמצעות מונחי החיפוש “המעי והתא החיסונית ובידוד” חושף מעל 200 פרסומים המתארים שיטות עיכול קטן כדי לחלץ תאים חיסוניים. עם זאת, החיפוש ספרות דומה לתשואות המעי הגס לא היטב פרוטוקולים המציין בידוד של תאים חיסוניים מן המעי הגס. זה יכול להיות בגלל המעי הגס יש יותר שרירי וביניים בשכבות, עיבוד זה קשה יותר לעכל לחלוטין מאשר המעי הדק. בניגוד לפרוטוקולים קיימים, פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי בקולאגנאז E מתוך קלוסטרידיום hiסטוליום ללא הקולגן האחרים בקטריות (קולאגנאז D/קולאגנאז I). אנו מדגימים כי, באמצעות פרוטוקול זה, העיכול של רקמת המעי הגס ניתן להשיג תוך שמירה על איכות הבטן מבודדים תאים חיסוניים ברורים (MNC) ללא תוספת של ריאגנטים נגד החלקה כגון נתרן versenate (EDTA), Dispase השני, ו ביטול הכרה i (dnase)21,22,23. פרוטוקול זה הוא ממוטב כדי לאפשר הפקת חזקה מיותרת של MNC קיימא מן הנקודתיים murine עבור מחקרים מכוונים נוספים צריך להשאיל את עצמו למחקר של אימונולוגיה של המעי הגס או (עם שינויים) את המעי הדק24, . עשרים וחמש
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול חזותי זה מתאר שיטות נסבל היטב עבור בידוד של תאים מוננועיים במעי הגס כולל לימפוציטים קיננה (LPL). בהינתן כי פרוטוקול זה היה אופטימיזציה בהערכת חמור לאחר השתלת מודלים העכבר כאשר ציטוקינים דלקתיים ופציעה רקמות להשאיל את עצמם הכדאיות הירודה של MNC התאושש, אנו מצפים כי שיטות אלה ניתן לתר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים #1K08HL088260 ו #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., ח, S.J.), ואת הקרן Batchelor למחקר ילדים (D.M., ח, S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 ו-BALB/c עכברים המשמשים במחקר זה היו מונולדו במתקן שלנו או שסופקו על ידי מעבדות ג’קסון או Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
