콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리
Summary
이 프로토콜의 목표는 콜라게나제를 사용하여 조직의 효소 소화에 의해 결장의 라미나 프로피리아에 있는 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 세포의 효율적인 분리를 허용하여 단일 세포 현탁액을 생성하여 강력한 면역 세포 증식에 사용할 수 있습니다.
Abstract
창 자 본문에 면역 세포의 가장 큰 수에 가정. 작고 큰 장 내 면역 계통은 외인성 항원에 노출하고 강력한 미생물 유래 면역 자극에 대한 반응을 조절합니다. 이러한 이유로, 장은 크론병및 궤양성 대장염, 이식편 대 숙주질환(GVHD)과 같은 염증성 장질환을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 질병에서 면역 조절 및 염증의 주요 표적 부위이다. 골수 이식 (BMT), 그리고 많은 알레르기 및 전염성 조건. 위장 염증과 대장염의 뮤린 모델은 GI 합병증을 연구하고 예방 및 치료를 위한 전략을 전임상적으로 최적화하는 데 많이 사용됩니다. 장에서 면역 세포의 격리 및 phenotypic 분석을 통해 이러한 모델에서 수집 된 데이터는 위장 및 전신 염증 성 질환을 개량 할 수있는 추가 면역 이해에 중요하다. 이 보고서는 혼합 실리카 기반 밀도 구배 계면을 사용하여 결장으로부터 단핵 세포(MNC)를 분리하기 위한 매우 효과적인 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 오염 된 파편을 최소화하면서 생존 가능한 백혈구의 상당수를 재현하여 유세포 분석 또는 다른 방법에 의해 후속 면역 자형법을 허용합니다.
Introduction
위장 (GI) 관은 주로 음식에서 영양소의 처리 및 재흡수에 전념하지만, 위관은 또한 혈관, 림프, 신경계 및 수많은 다른 장기의 무결성에 중심 적인 역할을 유지합니다. 그것의 점막 및 점막 면역 계통1. GI 면역 계통은 음식, 공생 박테리아, 또는 침입 병원체에서 외국 항원에 그것의 일정한 노출 때문에 위장 및 전신 건강 둘 다에 있는 영향력 있는 역할을 합니다1,2. 따라서, GI 면역 계통은 병원성 항원1,2에적절히 반응하면서 비병원성 항원을 용인하는 섬세한 균형을 유지해야 한다. 관용과 방어의 균형이 중단되면, 국소화 또는 전신 면역 dysregulation 및 염증은 질병의 무수한 의 결과로 발생할 수 있습니다1,2,3.
창자 항구 적어도 70% 본문에 있는 모든 림프 세포의4. 대부분의 1 차적인 면역학 상호 작용은 창자에 있는 3개의 면역 국중 적어도 1개를 관련시킵니다: 1) Peyer의 패치, 2) 상피 내 림프구 (IEL) 및 3) 라미나 프로피아 림프구 (LPL). 이들의 각각은 창자5에있는 일반적인 면역 도전에 급속하게 반응하는 면역 세포의 복잡한 상호 연결된 네트워크로 이루어져 있습니다. 근육 점막 위의 기질로 제한되는 느슨하게 구조화 된 라미나 프로프리아는 창자 점막의 결합 조직이며 융모, 혈관 구조, 림프 배수 및 점막 신경계뿐만 아니라 많은 선천성 신경 조직에 대한 비계를 포함합니다. 및 적응 면역 하위 집합6,7,8,9. LPL은CD4+ 및CD8+ T 세포로 구성되며, 약 2:1의 비율로, 혈장 세포 및 골수성 혈통 세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및 대식세포6을포함한다.
다양한 질병 상태에 관련되어 있는 면역 dysregulation 및 창자의 염증을 이해에 있는 증가하는 관심사가 있습니다. 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 조건은 모두 대장염증10,11,12의다양한 수준을 나타낸다. 추가적으로, 동종 골수 이식 (allo-BMT)를 겪는 골수 또는 면역 계통의 악성 또는 비 악성 무질서를 가진 환자는 1) 조건정 식이요법에서 직접 독성을 포함하여 대장염의 각종 양식을 개발할 수 있습니다 BMT 전, 2) BMT 및 3) 이식편 대 숙주 질환(GVHD)에 의해 유발된 감염은 BMT13,14,15이후 조직에서 공여자 알로항원에 반응하는 기증자 형 T 세포에 의해 구동된다. 이 모든 포스트 BMT 합병증은 장의 면역 군대에 있는 중요한 변경 귀착됩니다16,17,18. 제안된 방법은 마우스 결장에서 면역 세포 축적의 신뢰할 수 있는 평가를 허용하고, BMT 후 뮤린 수용자에 적용될 때, 이식 내성 19에 관여하는 기증자 및 수용자 면역 세포 둘 다의 효율적인 분석법을 용이하게한다. ,20. 창 자 염증의 추가 원인은 악성 포함, 음식 알레르기, 또는 창 자 미생물의 중단. 이 프로토콜은 결장에서 창자 단핵 세포의 접근을 허용하고, 수정으로, 이 전임상 뮤린 모형의 소장의 백혈구에.
“내장 및 면역 세포 및 격리”라는 검색어를 사용한 PubMed 검색은 면역 세포를 추출하기 위해 소장 소화 방법을 설명하는 200 개 이상의 간행물을 보여줍니다. 그러나, 결장에 대 한 유사한 문학 검색 콜론에서 면역 세포의 격리를 지정 하는 잘 설명 된 프로토콜을 산출. 이것은 결장이 더 많은 근육과 간질 층을 가지고 있기 때문일 수 있습니다, 그것을 더 어렵게 소장 보다는 소화하기 위하여 렌더링합니다. 기존 프로토콜과 달리, 이 프로토콜은 다른 세균성 콜라게나제(콜라게나제 D/콜라게나아제 I)없이 클로스트리디움 의 콜라주나아제 E를 사용합니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여, 결장 조직의 소화가 나트륨 versenate (EDTA), Dispase II및 와 같은 반대로 응집 시약의 추가 없이 고립된 창자 단핵 면역 세포 (MNC)의 질을 보존하면서 달성될 수 있다는 것을 보여줍니다 deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. 이 프로토콜은 추가 지시 된 연구를 위해 뮤린 결장에서 생존 가능한 MNC의 재현 가능한 강력한 추출을 허용하도록 최적화되어 있으며 결장의 면역학 또는 소장 (수정)의 연구에 자신을 빌려주어야합니다24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 시각적 프로토콜은 라미나 프로피아 림프구(LPL)를 포함하는 결장 단핵 세포의 분리를 위한 잘 용납되는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 염증성 사이토카인과 조직 손상이 회복 된 MNC의 가난한 생존력에 자신을 빌려 심각한 이식 후 마우스 대장염 모델을 평가에 최적화 된 것을 감안할 때, 우리는 이러한 방법이 다른 것으로 번역 될 수 있음을 예상 결장 MNC의 현상학적 분석을 요구하는 응용 프…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 #1K08HL088260 및 #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) 및 소아 연구를위한 배치 재단 (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.)에 의해 지원되었습니다. 이 연구에서 사용된 C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 우리 시설에서 사육되었거나 잭슨 연구소 또는 타코닉에서 제공했습니다.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
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