Murine Colon से Lamina Propria मोनोन्यूक्लियर सेल के अलगाव Collagenase ई का उपयोग
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करना है जो कोलैजानेस का उपयोग करके ऊतक के एंजाइमी पाचन द्वारा बृहदान्त्र के पटल प्रोप्रिया में रहते हैं। इस प्रोटोकॉल मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के कुशल अलगाव के लिए अनुमति देता है जिसके परिणामस्वरूप एक एकल सेल निलंबन जो बदले में मजबूत इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
आंत शरीर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सबसे बड़ी संख्या के लिए घर है. छोटे और बड़े आंतों की प्रतिरक्षा प्रणाली exogenous एंटीजन के लिए पुलिस जोखिम और शक्तिशाली माइक्रोबियल व्युत्पन्न प्रतिरक्षा उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित. इस कारण से, आंत प्रतिरक्षा डिस्रेग्युलेशन और सूजन का एक प्रमुख लक्ष्य साइट है जिसमें कई बीमारियों शामिल हैं, लेकिन हड्डी के बाद क्रोहन रोग और अल्सरेटिव कोलाइटिस, भ्रष्टाचार-वर्सस-होस्ट रोग (जीवएचडी) जैसे सूजन आंत्र रोगों तक सीमित नहीं है। मज्जा प्रत्यारोपण (BMT), और कई एलर्जी और संक्रामक स्थितियों. जठरांत्र सूजन और कोलाइटिस के Murine मॉडल भारी जीआई जटिलताओं का अध्ययन करने के लिए और पूर्व नैदानिक रोकथाम और उपचार के लिए रणनीतियों का अनुकूलन करने के लिए उपयोग किया जाता है। आंत से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव और phenotypic विश्लेषण के माध्यम से इन मॉडलों से gleaned डेटा आगे प्रतिरक्षा समझ है कि जठरांत्र और प्रणालीगत सूजन विकारों को सुधारने के लिए लागू किया जा सकता करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह रिपोर्ट एक मिश्रित सिलिका आधारित घनत्व ढाल इंटरफेस का उपयोग कर बृहदान्त्र से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (MNC) के अलगाव के लिए एक अत्यधिक प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस विधि reproducibly व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स की एक महत्वपूर्ण संख्या को अलग करते हुए मलबे को कम करने, प्रवाह साइटोमेट्री या अन्य तरीकों से बाद में प्रतिरक्षा phenotyping की अनुमति.
Introduction
हालांकि जठरांत्र (जीआई) पथ मुख्य रूप से भोजन से पोषक तत्वों के प्रसंस्करण और पुनः अवशोषण के लिए समर्पित है, जीआई पथ भी संवहनी, लसीका, और तंत्रिका तंत्र और कई अन्य अंगों के माध्यम से की अखंडता में केंद्रीय भूमिकाओं को बनाए रखता है इसका म्यूकोसल और सबम्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रणाली1. जीआई प्रतिरक्षा प्रणाली दोनों जठरांत्र और प्रणालीगत स्वास्थ्य में एक प्रभावशाली भूमिका है भोजन से विदेशी प्रतिजनों के लिए अपने निरंतर जोखिम के कारण, commensal बैक्टीरिया, या रोगजनकों पर हमला1,2. इस प्रकार, जीआई प्रतिरक्षा प्रणाली को एक नाजुक संतुलन बनाए रखना चाहिए जिसमें यह रोगजनक एंटीजन1,2को उचित जवाब देते समय गैर-रोगजनक एंटीजन को सहन करता है। जब सहिष्णुता और रक्षा का संतुलन बाधित हो जाता है, स्थानीयकृत या प्रणालीगत प्रतिरक्षा अपविनियमन और सूजन हो सकती है जिसके परिणामस्वरूप असंख्य रोग1,2,3हो सकते हैं .
आंत शरीर में सभी लसीकाभ कोशिकाओं का कम से कम 70% हिस्सा है4. सबसे प्राथमिक इम्यूनोलॉजिक बातचीत में आंत में तीन प्रतिरक्षा स्टेशनों में से कम से कम एक शामिल है: 1) पीयर के पैच, 2) इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट (आईईएल) और 3) लेमिना प्रोपेरिया लिम्फोसाइट्स (एलपीएल)। इनमें से प्रत्येक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक जटिल परस्पर नेटवर्क होता है जो आंत5में सामान्य प्रतिरक्षा चुनौतियों का तेजी से जवाब देता है . पेशी mucosae ऊपर stroma करने के लिए प्रतिबंधित, ढीला संरचित पटल प्रोपरिया आंत mucosa के संयोजी ऊतक है और गांव के लिए मचान भी शामिल है, vasculature, लसीका जल निकासी, और mucosal तंत्रिका तंत्र, साथ ही कई सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा सबसेट6,7,8,9. एलपीएल में सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं को 2:1, प्लाज्मा कोशिकाओं और माइलॉयड वंश कोशिकाओं सहित, डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, eosinophils और मैक्रोफेज6के अनुमानित अनुपात में शामिल हैं।
प्रतिरक्षा विनियमन और आंत की सूजन को समझने में बढ़ती रुचि है क्योंकि यह विभिन्न रोग राज्यों से संबंधित है। क्रोहन रोग और अल्सरेटिव कोलाइटिस जैसी स्थितियां सभी कोलोनिक सूजन के विभिन्न स्तरों को प्रकट करती हैं10,11,12. इसके अतिरिक्त, मज्जा या प्रतिरक्षा प्रणाली के घातक या गैर घातक विकारों के साथ रोगियों को जो एक allogeneic अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण से गुजरना (एलो-बीएमटी) सहित कोलाइटिस के विभिन्न रूपों का विकास कर सकते हैं 1) कंडीशनिंग regimens से प्रत्यक्ष विषाक्तता बीएमटी से पहले, 2) बीएमटी के बाद इम्यूनोसुप्रेशन के कारण होने वाले संक्रमण और 3) कलम-वर्सस-होस्ट रोग (GVHD) दाता-प्रकार टी कोशिकाओं द्वारा संचालित बीएमटी13,14,15के बाद ऊतकों में दाता एलो-एंटिजन के लिए प्रतिक्रिया । इन सभी पोस्ट-बीएमटी जटिलताओं के परिणामस्वरूप आंतों के प्रतिरक्षा वातावरण में महत्वपूर्ण परिवर्तनहोताहै16 ,17,18. प्रस्तावित विधि माउस बृहदान्त्र में प्रतिरक्षा सेल संचय के एक भरोसेमंद मूल्यांकन की अनुमति देता है और, जब BMT के बाद murine प्राप्तकर्ताओं के लिए आवेदन किया, दोनों दाता और प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा प्रत्यारोपण सहिष्णुता में शामिल कोशिकाओं के एक कुशल परख की सुविधा19 ,20. आंत सूजन के अतिरिक्त कारणों में द्रोह, खाद्य एलर्जी, या आंत माइक्रोबायोम के विघटन शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल बृहदान्त्र से आंत mononuclear कोशिकाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है और, संशोधनों के साथ, इन पूर्व नैदानिक murine मॉडल में से किसी में छोटी आंत के ल्यूकोसाइट्स के लिए.
खोज शब्दों का उपयोग कर एक PubMed खोज “आंत्र और प्रतिरक्षा सेल और अलगाव” छोटी आंत पाचन के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को निकालने के लिए तरीकों का वर्णन 200 से अधिक प्रकाशनों से पता चलता है. हालांकि, बृहदान्त्र के लिए एक समान साहित्य खोज कोई अच्छी तरह से परिभाषित प्रोटोकॉल बृहदान्त्र से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव निर्दिष्ट पैदावार. यह हो सकता है क्योंकि बृहदान्त्र अधिक मांसपेशियों और अंतरालीय परतों है, यह और अधिक मुश्किल पूरी तरह से छोटी आंत से पचाने के लिए प्रतिपादन. मौजूदा प्रोटोकॉल के विपरीत, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से अन्य जीवाणु collagenases के बिना Clostridium हिस्टोलिटिकम से Collagenase ई का उपयोग करता है (Collagenase डी / हम प्रदर्शित करते हैं कि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, औपनिवेशिक ऊतक के पाचन प्राप्त किया जा सकता है, जबकि अलग आंत mononuclear प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गुणवत्ता के संरक्षण (MNC) ऐसे सोडियम versenate के रूप में विरोधी clumping अभिकर्मकों के अलावा के बिना (EDTA), dispase द्वितीय, और deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. इस प्रोटोकॉल आगे निर्देशित अध्ययन के लिए murine बृहदान्त्र से व्यवहार्य एमएनसी के reproducible मजबूत निष्कर्षण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित है और खुद को बृहदान्त्र के इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के लिए उधार देना चाहिए या (संशोधन के साथ) छोटी आंत24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस दृश्य प्रोटोकॉल lamina प्रोप्रिया लिम्फोसाइटों (LPL) सहित कोलनिक मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए अच्छी तरह से सहन तरीकों का वर्णन करता है. यह देखते हुए कि इस प्रोटोकॉल गंभीर पोस्ट ट्रांसप्लांट म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य अनुदान #1K08HL088260 और #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), और बाल चिकित्सा अनुसंधान के लिए Batchelor फाउंडेशन (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) द्वारा समर्थित किया गया था। C57BL/6 और BALB/c चूहों इस अध्ययन में इस्तेमाल किया या तो हमारी सुविधा में पैदा हुए थे या जैक्सन लैब्स या Taconic द्वारा प्रदान की.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
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