Isolering av lamina propria mononukleära celler från murina kolon använda kollagenas E
Summary
Målet med detta protokoll är att isolera mononukleära celler som bor i lamina propria av tjocktarmen genom enzymatisk nedbrytning av vävnaden med hjälp av kollagenase. Detta protokoll möjliggör en effektiv isolering av mononukleära celler vilket resulterar i en enda cellsuspension som i sin tur kan användas för robust immunophenotyping.
Abstract
Tarmen är hem till det största antalet immunceller i kroppen. De små och stora tarm immunsystem polisen exponering för exogena antigener och modulera svar på potenta mikrobiellt härledda immun stimuli. Av denna anledning, tarmen är en viktig mål plats för immun dysreglering och inflammation i många sjukdomar, inklusive men, inte begränsat till inflammatoriska tarmsjukdomar såsom Crohns sjukdom och ulcerös kolit, graft-versus-host sjukdom (GVHD) efter ben benmärgstransplantation (BMT), och många allergiska och infektiösa tillstånd. Murina modeller av gastrointestinal inflammation och kolit är tungt används för att studera GI komplikationer och att pre-kliniskt optimera strategier för förebyggande och behandling. Data som samlats in från dessa modeller via isolering och fenotypisk analys av immunceller från tarmen är avgörande för ytterligare immun förståelse som kan tillämpas för att lindra gastrointestinala och systemiska inflammatoriska sjukdomar. Denna rapport beskriver ett mycket effektivt protokoll för isolering av mononukleära celler (MNC) från tjocktarmen med hjälp av en blandad kiseldioxid-baserade densitet gradient gränssnitt. Denna metod isolerar reproducerbart ett betydande antal livskraftiga leukocyter samtidigt minimera förorenande skräp, vilket möjliggör efterföljande immun fenotypning av flödescytometri eller andra metoder.
Introduction
Även om den gastrointestinala (GI) tarmkanalen är främst tillägnad bearbetning och reabsorption av näringsämnen från mat, magtarmkanalen upprätthåller också centrala roller i integriteten av den vaskulära, lymfatiska, och nervsystemet och många andra organ genom dess slemhinnor och submukosala immunförsvar1. GI immunsystemet har en inflytelserik roll i både gastrointestinal och systemisk hälsa på grund av dess ständiga exponering för främmande antigener från livsmedel, kommensaler bakterier, eller invaderande patogener1,2. Således, GI immunsystemet måste upprätthålla en känslig balans där den tolererar icke-patogena antigener samtidigt reagera på lämpligt sätt att patogena antigener1,2. När balansen mellan tolerans och försvar störs, kan lokaliserad eller systemisk immun dysreglering och inflammation inträffa vilket resulterar i en myriad av sjukdomar1,2,3.
Tarmen hamnar minst 70% av alla lymfoida celler i kroppen4. De flesta primära immunologiska interaktioner involverar minst en av tre immun stationer i tarmen: 1) Peyers plåster, 2) intraepitelial lymfocyter (IEL) och 3) lamina propria lymfocyter (LPL). Var och en av dessa består av ett komplext sammanlänkat nätverk av immunceller som snabbt reagerar på normala immun utmaningar i tarmen5. Begränsad till stroma ovanför muscularis hinna mucosae, den löst strukturerade lamina propria är bindväv i tarmslemhinnan och inkluderar byggnadsställningar för villus, vasculature, lymfdränage, och slemhinnor nervsystemet, liksom många medfödda och adaptiva immunsubsets6,7,8,9. LPL består av CD4+ och CD8+ T celler i ett ungefärligt förhållande av 2:1, plasmaceller och myeloida Lineage celler inklusive, dendritiska celler, mastceller, eosinofiler och makrofager6.
Det finns ett växande intresse för att förstå immun dysreglering och inflammation i tarmen som den avser olika sjukdomstillstånd. Sådana tillstånd som Crohns sjukdom och ulcerös kolit alla manifestera varierande nivåer av kolon inflammation10,11,12. Dessutom, patienter med maligna eller icke-maligna sjukdomar i benmärgen eller immunsystemet som genomgår en allogen benmärgstransplantation (allo-BMT) kan utveckla olika former av kolit inklusive 1) direkt toxicitet från konditioneringsregimer före BMT, 2) infektioner orsakade av immunsuppression efter BMT och 3) transplantat-kontra-värd sjukdom (GVHD) driven av givare-typ T-celler reagerar på givare allo-antigener i vävnaderna efter BMT13,14,15. Alla dessa komplikationer efter BMT resultera i betydande förändringar i immun miljön i tarmarna16,17,18. Den föreslagna metoden möjliggör en tillförlitlig bedömning av immuncellernas ackumulering i musens kolon och, när den appliceras på murina mottagare efter BMT, underlättar en effektiv analys av både givar-och mottagar immunceller involverade i transplantations tolerans19 ,20. Ytterligare orsaker till Gut inflammation inkluderar maligniteter, födoämnesallergier, eller störningar i tarmen microbiome. Detta protokoll ger tillgång till Gut mononukleära celler från tjocktarmen och, med modifieringar, till leukocyter i tunntarmen i någon av dessa prekliniska murina modeller.
En PubMed sökning med hjälp av söktermerna “tarm och immun cell och isolering” avslöjar över 200 publikationer som beskriver metoder för tunntarmen nedbrytning för att extrahera immunceller. En liknande litteratursökning efter kolon ger dock inga väl avgränsade protokoll som specificerar isolering av immunceller från tjocktarmen. Detta kan bero på att tjocktarmen har mer muskulös och interstitiell lager, vilket gör det svårare att helt smälta än tunntarmen. Till skillnad från befintliga protokoll använder detta protokoll specifikt Kollagenase E från Clostridium histolyticum utan andra bakteriella kollagenaser (Kollagenase D/kollagenas I). Vi visar att med hjälp av detta protokoll, kan nedbrytning av kolon vävnad uppnås samtidigt som kvaliteten på isolerade Gut mononukleära immunceller (MNC) utan tillsats av anti-clumping reagenser såsom natrium Versenate (EDTA), Dispase II, och deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Detta protokoll är optimerat för att möjliggöra reproducerbar robust utvinning av livskraftiga MNC från murina kolon för vidare riktade studier och bör låna sig till studiet av immunologi i tjocktarmen eller (med modifieringar) tunntarmen24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta visuella protokoll beskriver väl tolererade metoder för isolering av kolon mononukleära celler inklusive lamina propria lymfocyter (LPL). Med tanke på att detta protokoll var optimerat för att utvärdera svår efter transplantation mus kolit modeller där inflammatoriska cytokiner och vävnadsskada lämpar sig för dålig lönsamhet av återvunna MNC, vi räknar med att dessa metoder kan översättas till andra tillämpningar som kräver fenotypisk analys av kolon MNC. Dessa inkluderar, men, är inte begränsa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag #1K08HL088260 och #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), och Batchelor Stiftelsen för pediatrisk forskning (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 och BALB/c möss som används i denna studie var antingen uppvuxna i vår anläggning eller tillhandahålls av Jackson Labs eller Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
