В vitro Поколение мыши сердце поле конкретных сердечных клеток-прародителей
Summary
Цель этого метода состоит в том, чтобы генерировать сердце поле конкретных клеток-прародителей в пробирке для того, чтобы изучить спецификации клеток-прародителей и функциональные свойства, а также для создания камерных конкретных сердечных клеток для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний.
Abstract
Плюрипотентные стволовые клетки предлагают большой потенциал для понимания развития сердца и болезней и для регенеративной медицины. Хотя последние достижения в области развития кардиологии привели к генерации сердечных клеток из плюрипотентных стволовых клеток, неясно, если два сердечных полей – первое и второе сердце поля (FHF и SHF) – индуцируются в плюрипотентных стволовых клеток систем. Для решения этой проблемы мы создали протокол для спецификации in vitro и изоляции клеток сердечного полевого декабриста. Мы использовали эмбриональные линии стволовых клеток, несущие Hcn4-GFP и Tbx1-Cre; Роза-RFP репортеров FHF и SHF, соответственно, и живые клетки иммуно-сточки клеточного белка cxcr4, маркер SHF. При таком подходе мы создали клетки-прародители, которые переизбавляли функциональные свойства и транскриптом их аналогов in vivo. Наш протокол может быть использован для изучения ранней спецификации и сегрегации двух сердечных полей и для создания камерных клеток сердца для моделирования сердечных заболеваний. Так как это в пробирке органоидной системы, он не может обеспечить точную анатомическую информацию. Тем не менее, эта система преодолевает низкую доступность эмбрионов ступенчатой стадии и может быть высококлассным для высокопроизводительных экранов.
Introduction
Использование плюрипотентных стволовых клеток (PSCs) произвелреволюцию в области регенерации сердца и персонализированной медицины с конкретными миоцитами для пациентов для моделирования заболеваний и медикаментозной терапии1,2,3, 4. Совсем недавно, в пробирке протоколы для генерации предсердий против желудочков, а также кардиостимулятор, как PSC полученных кардиомиоцитов были разработаны5,6. Однако, может ли кардиогенез быть воссоздан в пробирке для изучения развития сердца и последующего создания желудочковых камер-специфических сердечных клеток до сих пор неясно.
Во время раннего эмбрионального развития, мезодермальные клетки под влиянием секретных морфогенов, таких как BMP4, Wnts и Activin A образуют примитивную полосу7. Сердечные мезодермальные клетки, отмеченные выражением Mesp1, мигрируют передним и в последнее время, чтобы сформировать сердечный полумесяц, а затем примитивную сердечную трубку7,8. Эта мигрированная группа клеток включает в себя две очень разные популяции клеток-прародителей сердца (КПК), а именно первое и второе поле сердца (FHF и SHF)9,10. Клетки из SHF являются высоко пролиферативными и мигрирующими и в первую очередь отвечают за удлинение и петлю сердечной трубки. Кроме того, SHF клетки дифференцируются к кардиомиоцитов, фибробластов, гладких мышц и эндотелиальных клеток, как они входят в сердечную трубку, чтобы сформировать правый желудочек, правый желудочковой оттока и большую часть обоих предсердий7,10. В отличие от этого, клетки FHF менее пролиферативной и мигрирующих и дифференцировать в основном кардиомиоцитов, поскольку они приводят к левому желудочку и меньшая часть предсердий11. Кроме того, shF прародители отмечены выражением Tbx1, FGF8, FGF10 и Six2 в то время как клетки FHF выражают Hcn4 и Tbx511,12,13,14,15.
PSCs может дифференцировать к всем 3 слоямзародыша и затем к любому типу клетки в теле 4,16. Таким образом, они предлагают огромный потенциал для понимания развития сердца и для моделирования конкретных дефектов развития, приводящих к врожденным порокам сердца, наиболее частой причиной врожденных дефектов17. Большая подгруппа врожденных пороков сердца включает камерно-специфические сердечные аномалии18,19. Тем не менее, до сих пор неясно, являются ли они происходят из аномальной разработки поля сердца. Кроме того, учитывая неспособность кардиомиоцитов размножаться после рождения, были предприняты значительные усилия посозданию сердечной ткани для регенерации сердца 1,7,20. Учитывая физиологические и морфологические различия между сердечными камерами, генерация камерной сердечной ткани с использованием ПСК имеет важное значение. Хотя последние достижения в области развития кардиологии привели к надежной генерации сердечных клеток из PSCs, до сих пор неясно, если два сердца поля могут быть индуцированы в системах PSC.
Для повторения кардиогенеза in vitro и изучения спецификации и свойств КПК, мы ранее использовали систему, основанную на дифференциации PSC полученных сердечных сфероидов21,22,23,24. Недавно мы создали эмбриональные стволовые клетки мыши (mESCs) с GFP и RFP репортеров под контролем гена FHF Hcn4 и гена SHF Tbx1, соответственно (mESCsTbx1-Cre; Роза-РФП; HCN4-GFP) 25. В пробирке дифференцированные mESCs образуются сердечные сфероиды, в которых GFP и RFP’ клетки появились из двух различных областей мезодермальных клеток и узорчатые в комплементарной манере. В результате клетки ГФПЗ и ПФР, проявляющие соответственно характеристики FHF и SHF, определяемые анализами РНК-секвенирования и клонального анализа. Важно отметить, что с помощью mESCs проведения Isl1-RFP репортер (mESCIsl1-RFP), мы обнаружили, что SHF клетки были точно отмечены клеточной поверхности белка CXCR4, и это может позволить изоляцию сердца поля конкретных клеток без трансгенов. В настоящем протоколе будет описано генерация и изоляция сердечных полевых КТК от МСК, которые могут служить ценным инструментом для изучения камерных сердечных заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
В нашем протоколе мы описываем методологию генерации сердечных сфероидов и изолированных сердечных полевых КПК. Они могут быть использованы для изучения механизмов спецификации КТК и их свойств, а также для моделирования сердечных камер ных заболеваний. Одна из ранее опубликованных ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. была поддержана Магией, которая имеет значение и AHA. К. К. получил поддержку грантов от NICHD/NIH (R01HD086026), AHA и MSCRF.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
