Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Un pipeline de bioinformatique pour analyser avec précision et efficacité les transcriptomes microARN dans les plantes

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/59864
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 2, 1
1Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology, Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, 2State Key Laboratory of Protein and Plant Gene Research, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, School of Advanced Agricultural Sciences and School of Life Sciences, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Un pipeline bioinformatique, à savoir miRDeep-P2 (miRDP2 pour faire court), avec des critères de miARN végétal mis à jour et un algorithme révisé, pourrait analyser avec précision et efficacité les transcriptomes de microARN chez les plantes, en particulier pour les espèces ayant des génomes complexes et volumineux.

Abstract

Les microARN (miARN) sont de 20 à 24 nucléotides (nt) endogènes petits ARN (sRNAs) largement existant dans les plantes et les animaux qui jouent un rôle puissant dans la régulation de l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Le séquençage des bibliothèques de sRNA par les méthodes de séquençage de la prochaine génération (NGS) a été largement utilisé pour identifier et analyser les transcriptomes de miRNA au cours de la dernière décennie, ce qui a entraîné une augmentation rapide de la découverte de miRNA. Cependant, deux défis majeurs se posent dans l'annotation de miRNA de plante due à la profondeur croissante des bibliothèques séquentielles de sRNA aussi bien que la taille et la complexité des génomes de plante. Tout d'abord, de nombreux autres types d'ARNr, en particulier, les ARN à court interférant (siRNAs) des bibliothèques d'ARNde, sont annotés à tort comme miRNAs par de nombreux outils informatiques. Deuxièmement, il devient un processus extrêmement long pour analyser les transcriptomes miRNA chez les espèces végétales avec des génomes grands et complexes. Pour surmonter ces défis, nous avons récemment mis à niveau miRDeep-P (un outil populaire pour les analyses de transcriptome miRNA) à miRDeep-P2 (miRDP2 pour faire court) en employant une nouvelle stratégie de filtrage, en remaniant l'algorithme de notation et en incorporant miRNA usine nouvellement mis à jour critères d'annotation. Nous avons testé miRDP2 contre des populations d'ARNs séquentielles dans cinq plantes représentatives présentant une complexité génomique croissante, y compris l'arabidopsis, le riz, la tomate, le maïs et le blé. Les résultats indiquent que miRDP2 a traité ces tâches avec une très grande efficacité. En outre, miRDP2 a surpassé les autres outils de prédiction en ce qui concerne la sensibilité et la précision. Pris ensemble, nos résultats démontrent miRDP2 comme un outil rapide et précis pour analyser les transcriptomes miRNA des plantes, donc un outil utile pour aider la communauté à mieux annoter miRNAs dans les plantes.

Introduction

L'une des découvertes les plus passionnantes des deux dernières décennies en biologie est le rôle proliférant des espèces d'ARNs dans la régulation des diverses fonctions du génome1. En particulier, les miARN constituent une classe importante de 20 à 24 sRNAs dans les eucaryotes, et fonctionnent principalement au niveau post-transcriptionnel en tant que régulateurs génétiques de premier plan tout au long des étapes de développement du cycle de vie ainsi que dans les réponses de stimulus et de stress2,3. Chez les plantes, les miARN proviennent de transcriptions primaires appelées pri-miRNAs, qui sont généralement transcrites par l'ARN polymérase II comme unités de transcription individuelles4,5. Traitées par des machines cellulaires évolutivement conservées (Drosha RNase III chez les animaux, comme dicER chez les plantes), les pri-miRNAs sont excisées dans les précurseurs immédiats de miRNA, les pré-miRNAs, qui contiennent des séquences formant des structures intramoléculaires de boucle de tige6,7. Les pré-miRNAs sont ensuite transformés en intermédiaires à double brin, à savoir les duplex miRNA, constitués du brin fonctionnel, du miRNA mature et du partenaire moins fréquemment fonctionnel,miRNAMD 2,8. Après avoir été chargés dans le complexe de silençage induit par l'ARN (RISC), les miARN matures pouvaient reconnaître leurs cibles d'ARNm en fonction de la complémentarité de la séquence, ce qui a entraîné une fonction réglementaire négative2,8. miRNAs pourrait soit déstabiliser leurs transcriptions cibles ou empêcher la traduction cible, mais l'ancienne manière est dominée dans les plantes8,9.

Depuis la découverte fortuite du premier miRNA dans le nématode Caenorhabditis elegans10,11, beaucoup de recherche a été engagée à l'identification miRNA et son analyse fonctionnelle, en particulier après la disponibilité de la méthode NGS. La large application de la méthode NGS a grandement favorisé l'utilisation d'outils informatiques conçus pour saisir la caractéristique unique des miARN, tels que la structure en boucle de tige des précurseurs et leur accumulation préférentielle de lectures de séquence séquencés sur le miRNA mature et le miRNAMD. En conséquence, les chercheurs ont obtenu un succès remarquable dans l'identification des miARN chez diverses espèces. Basé sur un modèle de probabilité précédemment décrit12,nous avons développé miRDeep-P13, qui a été le premier outil de calcul pour découvrir des miARN végétaux à partir de données NGS. miRDeep-P visait spécifiquement à surmonter les défis du décodage des miARN végétaux avec une longueur de précurseur plus variable et de grandes familles paralogues13,14,15. Après sa sortie, ce programme a été téléchargé des milliers de fois et utilisé pour annoter les transcriptomes miRNA dans plus de 40 espèces végétales16. Propulsé par des outils basés sur NGS comme miRDeep-P, il ya eu une augmentation spectaculaire du nombre de miRNAs enregistrés dans le dépôt de miRNA public miRBase17, où plus de 38.000 articles miRNA sont actuellement hébergés (libération 22.1) par rapport à seulement 500 articles miRNA (libération 2.0) en 200818.

Cependant, deux nouveaux défis ont surgi de l'annotation de miRNA de plante. Tout d'abord, des ratios élevés de faux positifs ont eu un impact important sur la qualité des annotations miRNA végétales16,19 pour les raisons suivantes : 1) un déluge d'ARN endogènes brefs interférants (siRNAs) des bibliothèques ngS sRNA ont été annotés à tort comme miRNAs en raison de l'absence d'un miRNA rigoureux et de critères; 2) pour les espèces sans information a priori miRNA, les faux positifs prédits sur la base des données NGS sont difficiles à éliminer. En utilisant miRBase à titre d'exemple, Taylor et coll.20 ont constaté qu'un tiers des entrées de miRNA des plantes dans le dépôt public21 (libération 21) n'avaient pas de preuves convaincantes à l'appui et même les trois quarts des familles de miRNA végétaux étaient discutables. Deuxièmement, il devient un processus extrêmement long pour prédire les miARN végétaux avec des génomes grands et complexes16. Pour surmonter ces défis, nous avons mis à jour miRDeep-P en ajoutant une nouvelle stratégie de filtrage, en remaniant l'algorithme de notation et en intégrant de nouveaux critères pour l'annotation miRNA végétale, et avons publié la nouvelle version miRDP2. En outre, nous avons testé miRDP2 à l'aide d'ensembles de données NGS sRNA avec des tailles de génome s'agrandit progressivement : Arabidopsis, riz, tomate, maïs et blé. Comparé à cinq autres outils largement utilisés et à son ancienne version, miRDP2 a analysé ces données d'ARNs et analysé les transcriptomes de miRNA plus rapidement avec une précision et une sensibilité améliorées.

Contenu du paquet miRDP2
Le paquet miRDP2 se compose de six scripts Perl documentés qui doivent être exécutés de façon séquentielle par le script bash préparé. Des six scripts, trois (convert_bowtie_to_blast.pl, filter_alignments.pl, et excise_candidate.pl) sont hérités de miRDeep-P. Les autres scripts sont modifiés à partir de la version originale. Les fonctions des six scripts sont décrites dans les éléments suivants :

preprocess_reads.pl filtre les lectures d'entrée, y compris les lectures qui sont trop longues ou trop courtes (lt;19 nt ou 'gt;25 nt), et se lit en corrélation avec les séquences Rfam ncRNA, ainsi que des lectures avec RPM (Reads Per Million) moins de 5. Le script récupère ensuite des lectures corrélées à des séquences matures connues de miRNA. Les fichiers d'entrée sont des lectures originales dans le format FASTA/FASTQ et la sortie bowtie2 de lectures cartographiques vers des séquences miRNA et ncRNA.

La formule de calcul du RPM est la suivante :

Equation 1

convert_bowtie_to_blast.pl change le format noeud papillon en format BLAST-parsed. Le format blast-parsed est un format tabulaire séparé personnalisé dérivé du format standard NCBI BLASToutput.

filter_alignments.pl filtre les alignements de séquençage profond se lit à un génome. Il filtre les alignements partiels ainsi que les lectures multi-alignées (coupure de fréquence spécifiée par l'utilisateur). L'entrée de base est un fichier en format BLAST-parsed.

excise_candidate.pl élimine les séquences précurseurs potentielles d'une séquence de référence à l'aide de lectures alignées comme lignes directrices. L'entrée de base est un fichier en format BLAST-parsed et un fichier FASTA. La sortie est toutes les séquences précurseurs potentiels en format FASTA.

mod-miRDP.pl a besoin de deux fichiers d'entrée, fichier de signature et fichier de structure, qui est modifié à partir de l'algorithme de base miRDeep-P en modifiant le système de notation avec des paramètres spécifiques à l'usine. Les fichiers d'entrée sont des fichiers de structure précurseur point-bracket et lit le fichier de signature de distribution.

mod-rm_redundant_meet_plant.pl a besoin de trois fichiers d'entrée : chromosome_length, précurseurs et original_prediction générés par mod-miRDP.pl. Il génère deux fichiers de sortie, fichier prévu non redondant et fichier prévu filtré par les critères de miRNA végétale récemment mis à jour. Les détails sur le format du fichier de sortie sont décrits à la section 1.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Installation et essais

  1. Télécharger les dépendances requises: Bowtie222 et RNAfold23. Les paquets compilés sont recommandés.
    1. Téléchargez Bowtie2, un outil de cartographie de lecture, à partir de son site d'origine (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml).
    2. Télécharger RNAfold, un outil du paquet de Vienne utilisé pour prédire la structure secondaire de l'ARN, à partir de http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/.
    3. Avant d'installer miRDP2, assurez-vous que ces deux dépendances sont correctement installées, et personnalisez le fichier d'environnement bash (par exemple, .bashrc) pour définir un PATH correct pour ces deux dépendances.
      REMARQUE : D'autres outils de cartographie tels que Bowtie24 conviennent également au miRDP2; Bowtie ou Bowtie2 peuvent être utilisés après la version 1.1.3.
  2. Pour télécharger le paquet miRDP2, rendez-vous dans https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/latest_version/ et allez chercher les fichiers tarball.
  3. Avant d'installer miRDP2, assurez-vous que Perl est dans le PATH. Pour installer miRDP2, extraire tout le contenu du fichier tarball téléchargé dans un dossier (lignes de commande comme dans 1.4.2), puis définir le chemin du dossier dans le PATH.
    REMARQUE : Un nœud informatique ou informatique avec au moins 8 Go de RAM et 100 Go de stockage sont recommandés pour exécuter miRDP2.
  4. Testez le pipeline MiRDP2.
    1. Pour vérifier si miRDP2 a été correctement installé, utilisez les données de test et la sortie attendue trouvée dans https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/. Les données de test contiennent un fichier de séquençage GSM formaté et un fichier du génome Arabidopsis thaliana.
    2. Déplacez tous les fichiers téléchargés vers le répertoire de travail actuel :
      mv miRDP2-v.tar.gz TestData.tar.gz ncRNA_rfam.tar.gz -lt;user_selected_folder-gt;
      cd lt;user_selected_folder-gt;
    3. Extraire les fichiers de tarball comprimé:
      goudron 'xvzf miRDP2-v'.tar.gz
      goudron 'xvzf TestData.tar.gz
      goudron 'xvzf ncRNA_rfam.tar.gz
    4. Construire l'indice de référence du génome d'Arabidopsis :
      bowtie2-build -f ./TestData/TAIR10_genome.fa ./TestData/TAIR10_genome
    5. Construire l'indice de référence ncRNA:
      bowtie2-build -f ./ncRNA_rfam.fa ./1.1.3/script/index/rfam_index
    6. Exécuter le pipeline miRDP2 :
      bash ./1.1.3/miRDP2-v1.1.3_pipeline.bash ./TestData/TAIR10_genome.fa -i ./ TestData/TAIR 10_genome ./TestData/GSM2094927.fa .o .
      REMARQUE : Les commandes Linux utilisées sont en caractères gras et italiques, avec des options de ligne de commande en italique. indique la version de miRDP2 (la version actuelle est 1.1.3). La commande de construction bowtie2 devrait prendre environ 10 minutes, et le pipeline miRDP2 devrait se terminer en quelques minutes
  5. Vérifiez les sorties de test.
    1. Notez qu'un dossier nommé 'GSM2094927-15-0-10' est automatiquement généré dans 'lt;user_selected_folder'gt;, contenant tous les fichiers intermédiaires et les résultats.
    2. Vérifiez que le fichier de sortie délimité par l'onglet GSM2094927-15-0-10_filter_P_prediction, la sortie finale des miARN prédits, contient des colonnes qui indiquent l'id chromosomique, la direction du brin, le représentant lit id, précurseur id, emplacement miRNA mature, précurseur l'emplacement, la séquence mature et la séquence précurseur. Notez le fichier de lit supplémentaire dérivé de ce fichier pour faciliter une analyse plus approfondie.
    3. Vérifiez le fichier "progress_log", qui fournit des informations sur les étapes terminées, et les fichiers "script_log" et "script_err", qui contiennent la sortie du programme et les avertissements.
      REMARQUE: Actuellement, nous avons testé miRDP2 sur deux plates-formes Linux, y compris CentOS version 6.5 sur un serveur de cluster, et Cygwin 2.6.0 sur le système PC Windows, et miRDP2 devrait travailler sur des systèmes similaires qui prennent en charge Perl.

2. Identifier les nouveaux miRNAs

  1. Avant d'exécuter le pipeline, assurez-vous que les lectures d'entrée sont prétraitées en format approprié.
    REMARQUE : La nouvelle version 1.1.3 de miRDP2 peut accepter les fichiers de format FASTQ originaux comme entrées, bien que le processus de mise en forme des lectures soit effectué comme dans les versions précédentes.
    1. Tout d'abord, retirer les adaptateurs des extrémités de 5' et 3' du séquençage profond se lit (si présent).
    2. Deuxièmement, l'anèsre du séquençage profond se lit dans le format FASTA.
    3. Troisièmement, supprimer la redondance de telle sorte que les lectures avec séquence identique sont représentés avec une entrée EXPRES unique et unique.
    4. Enfin, assurez-vous que tous les identificateurs FASTA sont uniques. Chaque identificateur de séquence doit se terminer par un « _x » et un entier, indiquant le numéro de copie de la séquence exacte qui a été récupérée dans les ensembles de données de séquençage profond. Une façon d'assurer l'identifiant FASTA unique est d'inclure un numéro d'exécution dans l'ID. Pour référence, voir le fichier GSM2094927.fa dans les données de test (https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/).
    5. Voir ce qui suit pour des exemples de lectures correctement formatées :

      read0_x29909
      TTTGGATTGAAGGGAGCTCTTA TTTG
      read1_x36974
      TTCCACAGCTTTTTTTGAACTG
      read2_x32635
      TTCCACAGCTTTTTTTGAACTT
  2. Construire des indices de référence.
    1. Pour la référence du génome, pour gagner du temps, téléchargez les fichiers d'index Bowtie2 sur le site iGenomes(https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html) si les séquences génomiques des espèces d'intérêt ont été indexées. Dans le cas contraire, les utilisateurs indexent les séquences de référence et conservent le fichier d'index pendant un certain temps jusqu'à ce que le projet soit terminé puisque la séquence du génome pourrait devoir être réindexée. Les détails sur la façon d'indexer une référence génomique sont inclus dans le manuel bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml).
    2. Un autre indice ncRNA non-miRNA est également nécessaire pour filtrer les séquences bruyantes d'autres fragments d'ARN non codants. Le fichier est une collection de séquences principales ncRNA de Rfam, y compris l'ARNr, l'ARTT, le snRNA et le snoRNA. Pour établir cet indice, veuillez vous référer à la partie 1.4, car l'indice doit être placé et nommé correctement, c'est-à-dire le site de l'miRDP2_version./script/index/rfam_index.
  3. Exécuter miRDP2.
    1. Pour utiliser miRDP2 pour détecter de nouvelles miRNAs à partir de données de séquençage profond, exécutez le script bash dans le paquet pour démarrer le pipeline d'analyse (Un exemple peut être trouvé à l'étape 1.4):
      lt;path_to_miRDP2_folder'/miRDP2-v._pipeline.bash 'g 'lt;genome_file 'gt; -i 'lt;path_to_index/index_prefix 'gt; -f 'lt;seq_file 'gt; 'o 'lt;output_folder 'gt;
      où - indique la version du script de bash pipeline. Il y a trois paramètres qui peuvent être modifiés : 1) le nombre d'emplacements différents à laquelle une lecture peut être cartographiée, 2) le nombre d'inadéquation pour l'exécution du noeud papillon2, et 3) le seuil de RPM (Reads Per Million). Modifiez-les en utilisant les options L, M et R, respectivement. Une explication détaillée se trouve à la section 3.1.
  4. Vérifiez les sorties miRDP2.
    1. Notez que le dossier de sortie sera automatiquement généré sous l'output_folder et le nom de «lt;seq_file_name'à 15-0-10'; les 3 derniers numéros indiquent les valeurs (par défaut dans ce cas) pour les paramètres 1, 2 et 3, respectivement. Le fichier 'lt;seq_file_name'_filter_P_prediction contient des informations sur les miRNAs prédits finaux satisfaisant les critères d'annotation de miRNA de plante nouvellement mis à jour. Les détails sur le format du fichier de sortie sont décrits dans la partie 1.4.

3. Modifications et prudence à l'aide de miRDP2

  1. Paramètres qui peuvent être modifiés
    1. Utilisez l'option '-L'pour définir la limite du nombre d'emplacements auxquels une lecture peut être cartographiée (paramètre 1). Lire la cartographie à trop de sites sont éventuellement associés à des séquences répétées, et ne sont pas susceptibles de miRNAs. Le paramètre par défaut est de 15. Pour des espèces spécifiques, s'il y a des familles de miRNA avec beaucoup de membres, le premier paramètre peut être augmenté manuellement pour s'adapter au paysage génomique.
    2. Utilisez l'option '-M'pour définir les décalages autorisés pour le noeud papillon (paramètre 2). Le paramètre par défaut est 0.
    3. Utilisez l'option '-R' pour définir le seuil pour les lectures potentiellement correspondant aux miARN matures (paramètre 3). Pour réduire la consommation de temps et les faux positifs, filtre lit par RPM. Seules les lectures dépassant un certain seuil de RPM peuvent représenter des séquences matures de miARN plutôt que du bruit de fond, et seraient conservées pour une analyse plus approfondie. Le paramètre par défaut est de 10 tr/min.
    4. Notez que la modification de ces paramètres peut potentiellement affecter les performances et la consommation de temps. En général, une augmentation des paramètres 1 et 2 et une diminution du paramètre 3 généreraient un résultat moins rigoureux et un temps de fonctionnement plus long et vice versa.
  2. Redondance et miRNA
    1. Notez que les miARN de sortie de miRDP2 peuvent différer des miRNAs connus. Nous avons constaté que cela est principalement dû à l'une des deux raisons : l'hétérogénéité des miARN matures ou l'abondance relative de miRNA et de miRNA. Nous avons constaté que cela n'a pas d'incidence sur la sélection optimale des précurseurs et sur le profilage des gènes miARN connus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le pipeline d'annotation miRNA, miRDP2, décrit ci-dessus est appliqué à 10 bibliothèques publiques de sRNA-seq de 5 espèces végétales dont la longueur du génome a augmenté progressivement, y compris Arabidopsis thaliana, Oryza sativa (riz), Solanum lycopersicum (tomate), Zea mays (maïs) et Triticum aestivum (blé) (Figure 1A). Dans l'ensemble, pour chaque espèce, 2 bibliothèques représentatives de l'ARNM provenant de différents tissus (effondrées en lectures uniques, détails dans la section protocole) et leurs séquences génomiques indexées sont traitées sous forme de deux entrées (tableau 1). Cinq outils de prédiction computationnelle miRNA (miRDeep-P13, miRPlant25, miR-PREFeR26, miRA27, miReNA28) ont été sélectionnés pour faire la comparaison.

Test de temps d'exécution
Pour comparer le temps d'exécution et les performances de miRDP2 et d'autres cinq outils, nous avons installé cinq outils (miRDP2, miRDeep-P, miR-PREFeR, miRA et miReNA) dans un serveur cluster avec le système de version 6.5 de Cent OS. Ces programmes ont été exécutés avec les mêmes fichiers d'entrée, le matériel et la ressource (détails dans le fichier supplémentaire 1). Surtout, miRPlant est contrôlé à partir d'une interface graphique écrite en Java et n'a pas été en mesure d'exécuter sur le serveur. Au lieu de cela, nous avons testé miRPlant sur un PC avec Windows 10 alors que nous avons également testé miRDP2 et miRDeep-P sur ce PC (détails dans le fichier supplémentaire 1).

Pour les petites espèces de génome comme Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, et Solanum lycopersium, tous les programmes ont fonctionné correctement. Cependant, pour les grandes espèces de génomes telles que Zea mays et Triticum aestivum (y compris le lycopersium de Solanum pour le miRA), certains des programmes ont épuisé toutes les ressources informatiques et sont tombés en panne à mi-chemin. Par exemple, miReNA, miRA et miR-PREFeR n'ont pas réussi à générer des résultats, probablement en raison d'une déficience de mémoire lorsqu'ils traitaient des fichiers sam volumineux ou des fichiers intermédiaires. En particulier, les fichiers temporaires miRPlant consommé trop d'espace, et le résultat n'a pas été en mesure d'exécuter sur le PC lorsqu'il s'agit de grandes espèces de génome. miRDP2 a terminé ces processus de prédiction en très peu de temps, de minutes à heures (figure 1B). Ainsi, par rapport à son ancienne version et d'autres outils, le temps de fonctionnement de miRDP2 a été nettement raccourci.

Test de sensibilité et de précision
Puisque les miRNAs dans Arabidopsis sont intensivement étudiés, nous avons fait usage des miRNAs connus dans Arabidopsis dans miRBase21 (libération 22.1) pour évaluer miRDP2, et avons fait la comparaison avec d'autres outils. Comme indiqué précédemment19,26, les formules suivantes sont utilisées pour calculer la sensibilité et l'exactitude:

Equation 2

Equation 3

Les miARN connus sont ceux annotés dans miRBase. Un miRNA est désigné comme exprimé si les séquences matures ont plus de 5 RPM, et 75% lit sur le précurseur cartographié à maturité et étoiles miRNA séquences. Deux bibliothèques séquencées de l'Arabidopsis (tableau 1) ont été utilisées pour faire le test. miRDP2 (Figure 1C,D) a obtenu de meilleurs résultats en matière de sensibilité et de précision que d'autres outils.

Pris ensemble, ces résultats démontrent que miRDP2 est un outil rapide et précis pour analyser le transcriptome miRNA dans les plantes.

Figure 1
Figure 1 : Performance de miRDP2. (A) Taille du génome (en Gb) d'Arabidopsis thaliana (Ath), Oryza sativa (Osa), Solanum lycopersicum (Sly), Zea mays (Zma), Triticum aestivum (Tae). (B-D) Comparaison du temps d'exécution, de la sensibilité et de la précision de miRDP2 et d'autres cinq outils. Deux points correspondant à chaque outil indiquent que deux tests ont été effectués par chaque outil. Ce chiffre a été adapté de Kuang et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Espèces (abb.) Version génome bibliothèques sRNA
ID de bibliothèque Taille du fichier Total des lectures Lectures uniques Tissu
Arabidopsis thaliana (Ath) version 10 GSM2094927 GSM2094927 24,9 Mo 40,5 millions 9,7 millions Feuille adulte
GSM2412287 GSM2412287 29,5 Mo 45,1 millions 11,1 millions Feuille
Oryza sativa (Osa) version 7 GSM2883136 GSM2883136 44,2 Mo 54,9 millions 16,3 millions Semis
GSM3030848 GSM3030848 GSM3030848 34,7 Mo 49,1 millions 13,0 m Feuille de drapeau
Solanum lycopersicum (Sly) version 3 GSM1213985 GSM1213985 205,4 Mo 161,5 millions 58,0 m Feuille
GSM1976413 GSM1976413 118,5 Mo 139,3 millions 46,2 millions Racine
Zea mays (Zma) version 4 GSM1277437 GSM1277437 GSM1277437 158,4 Mo 266,1 millions 60,5 millions Semis
GSM1428531 GSM1428531 144,1 Mo 172,5 millions 56,3 millions Graines
Triticum aestivum (Tae) iwgsc 1 Annonces GSM1294660 GSM1294660 76,1 Mo 59,2 millions 29,6 millions Tirer
GSM1294661 GSM1294661 113,6 Mo 84,0 m 44,0 M Feuille

Tableau 1 : Génomes et bibliothèques sRNA utilisés pour tester le miRDP2 et d'autres outils. Cette table a été adaptée de Kuang et coll.16.

Dossier supplémentaire 1 : Comparaison du temps d'exécution, de la sensibilité et de la précision du miRDP2 et des cinq autres outils. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Exemples de miARN authentiques avec structure bifurque en boucles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Critères mis à jour pour l'annotation et les critères de miARN végétaux pour les miARN 23-nt et 24-nt. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 4 : Diagramme du flux de travail de miRDP2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avec l'avènement de NGS, un grand nombre de loci miRNA ont été identifiés à partir d'une quantité sans cesse croissante de données de séquençage de l'ARNde chez diverses espèces29,30. Dans la base de données communautaire centralisée miRBase21, les éléments miRNA déposés ont augmenté de près de 100 fois au cours de la dernière décennie. Cependant, par rapport aux miRNAs chez les animaux, les miARN végétaux ont de nombreuses caractéristiques uniques qui rendent l'identification/annotation plus compliquée13,14.

Tout d'abord, les précurseurs des miARN végétaux sont plus variables en longueur et en structure (Dossier supplémentaire 2)16. Pas comme la longueur relativement uniforme des précurseurs animaux miRNA autour de 70-90 nt, la longueur des précurseurs des plantes varient de plusieurs plis et pourrait atteindre plusieurs centaines de nts13,31. Cette différence introduit beaucoup d'incertitude lors de la prédiction de la structure secondaire des précurseurs miRNA, même si une coupure de la longueur des précurseurs est généralement fixé arbitrairement comme ne dépassant pas 300 nt19 (ce paramètre a été intégré dans miRDP2, et les utilisateurs expérimentés de miRDP2 pourrait ajuster cela par eux-mêmes). En outre, les familles de miRNA de plantes conservées ont tendance à avoir plus de membres, et la variation de longueur de ces membres est également souvent significative13. C'est la raison pour laquelle miRDP2 a le paramètre L, qui indique les plus grandes familles de miRNA potentielles dans la taille des membres. Ensemble, l'hétérogénéité des précurseurs de miRNA végétaux soulève de nombreuses difficultés pour leur annotation précise.

Deuxièmement, le bruit ou les faux positifs introduits par les siRNAs est difficile à éliminer. Outre les miRNAs, les méthodes NGS produisent également un déluge de siRNAs dans les bibliothèques séquentielles de l'ARNd. Même si les siRNAs pouvaient être séparés des miRNAs par leur biogenèse et leurs fonctions32,33, il est extrêmement difficile de les distinguer sur la base des données de séquençage et des outils d'exploitation minière. Les bases de données publiques telles que miRBase, argumentées par de nombreux chercheurs, se sont fortement détériorées par le grand nombre de siRNAs faux positifs, qui sont annotés à tort comme miRNAs20,31. Ainsi, les outils raffinés avec un nouvel ensemble strict de critères pour l'annotation de miRNA de plante comme les critères nouvellement mis à jour25 (dossier supplémentaire 3) sont fortement désirés dans le pipeline/processus d'annotation de miRNA.

Enfin, le temps de calcul pour l'anesthésie des bibliothèques de sRNA a augmenté de façon exponentielle lorsque la même méthode est transplantée d'une espèce génomique de petite taille à une espèce de grande taille. Les outils de calcul tels que miRDeep-P13 et miR-PREFeR26, en capturant et en quantifiant la distribution de signature des lectures de sRNA le long des précurseurs de miRNA, sont devenus deux méthodes populaires et sont largement utilisés pour annoter des miRNAs. La stratégie de cartographie, le processus d'excisage des candidats précurseurs et la prévision de la structure secondaire ultérieure exigent un temps de calcul considérable16. Lorsque ces outils sont utilisés pour analyser les données des génomes de petite taille comme arabidopsis à de grands comme le maïs, le temps de traitement des données est augmenté d'heures à jours, voire de semaines (Figure 1B), entraînant un effondrement fréquent du processus. Il est donc urgent d'innover sur les limitations qui s'y sont imposées.

Notre nouveau programme miRDP216, mis à jour à partir de miRDeep-P13, est conçu pour surmonter les défis mentionnés ci-dessus (Dossier supplémentaire 4). Dans ce programme, nous avons utilisé une nouvelle stratégie de filtrage, optimisé l'algorithme de notation et incorporé des critères d'annotation de miRNA de plantes récemment mis à jour. En raison de ces nouvelles caractéristiques, le temps de fonctionnement a été nettement raccourci lorsqu'il a été testé à l'aide de dix bibliothèques d'ARNs de cinq espèces végétales dont la taille du génome augmente. De plus, comparativement à d'autres outils, miRDP2 a affiché des performances supérieures en matière de sensibilité et de précision (figure 1). Pris ensemble, ces résultats démontrent que miRDP2 est un outil rapide et précis pour analyser les transcriptomes miRNA dans les plantes.

Il convient de mettre en garde que la compréhension actuelle sur les caractéristiques miRNA pourrait limiter les performances de tous les outils de calcul. Même les critères d'annotation miRNA récemment mis à jour sont basés sur un ensemble limité d'exemples bien étudiés. L'information déduite n'est donc qu'empirique. En fait, il a été démontré que des caractéristiques uniques des miARN existent chez différentes espèces végétales ou lignées3. En outre, des caractéristiques telles que les structures des régions en amont et en aval du duplex miRNA/miRNAMD jouent également des rôles critiques dans la biogenèse miRNA34,35, qui ne sont pas prises en compte dans les outils d'annotation actuels. Avec l'accumulation d'exemples bien étudiés chez plus d'espèces végétales, il est probable que des outils d'annotation encore plus avancés seront développés à l'avenir qui peuvent capturer des distinctions plus subtiles et classer les miARN avec un degré de précision plus élevé que les méthodes actuelles. Une nouvelle direction prometteuse d'annotation miRNA est d'intégrer les approches d'apprentissage automatique36 à mesure que la qualité des ensembles de données de formation et des critères d'annotation évoluent continuellement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (KJCX201917, KJCX20180425, et KJCX20180204) à XY et National Natural Science Foundation of China (31621001) à LL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Computer/computing node N/A N/A Perl is required; at least 8 GB RAM and 100 GB storage are recommended

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 94-108 (2009).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  3. Moran, Y., Agron, M., Praher, D., Technau, U. The evolutionary origin of plant and animal microRNAs. Nature Ecology Evolution. 1 (3), 27 (2017).
  4. Xie, Z., et al. Expression of Arabidopsis MIRNA genes. Plant Physiology. 138 (4), 2145-2154 (2005).
  5. Zhao, X., Zhang, H., Li, L. Identification and analysis of the proximal promoters of microRNA genes in Arabidopsis. Genomics. 101 (3), 187-194 (2013).
  6. Bologna, N. G., Mateos, J. L., Bresso, E. G., Palatnik, J. F. A loop-to-base processing mechanism underlies the biogenesis of plant microRNAs miR319 and miR159. EMBO JOURNAL. 28 (23), 3646-3656 (2009).
  7. Rogers, K., Chen, X. Biogenesis, turnover, and mode of action of plant microRNAs. Plant Cell. 25 (7), 2383-2399 (2013).
  8. Voinnet, O. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  9. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in Cell Biology. 25 (11), 651-665 (2015).
  10. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  11. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
  12. Friedlander, M. R., et al. Discovering microRNAs from deep sequencing data using miRDeep. Nature Biotechnology. 26 (4), 407-415 (2008).
  13. Yang, X., Li, L. miRDeep-P: a computational tool for analyzing the microRNA transcriptome in plants. Bioinformatics. 27 (18), 2614-2615 (2011).
  14. Meyers, B. C., et al. Criteria for annotation of plant MicroRNAs. Plant Cell. 20 (12), 3186-3190 (2008).
  15. Yang, X., Zhang, H., Li, L. Global analysis of gene-level microRNA expression in Arabidopsis using deep sequencing data. Genomics. 98 (1), 40-46 (2011).
  16. Kuang, Z., Wang, Y., Li, L., Yang, X. miRDeep-P2: accurate and fast analysis of the microRNA transcriptome in plants. Bioinformatics. , (2018).
  17. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2019).
  18. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  19. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  20. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  21. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 68-73 (2014).
  22. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  23. Lorenz, R., et al. ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6, 26 (2011).
  24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
  25. An, J., Lai, J., Sajjanhar, A., Lehman, M. L., Nelson, C. C. miRPlant: an integrated tool for identification of plant miRNA from RNA sequencing data. BMC Bioinformatics. 15, 275 (2014).
  26. Lei, J., Sun, Y. miR-PREFeR: an accurate, fast and easy-to-use plant miRNA prediction tool using small RNA-Seq data. Bioinformatics. 30 (19), 2837-2839 (2014).
  27. Evers, M., Huttner, M., Dueck, A., Meister, G., Engelmann, J. C. miRA: adaptable novel miRNA identification in plants using small RNA sequencing data. BMC Bioinformatics. 16, 370 (2015).
  28. Mathelier, A., Carbone, A. MIReNA: finding microRNAs with high accuracy and no learning at genome scale and from deep sequencing data. Bioinformatics. 26 (18), 2226-2234 (2010).
  29. Zhu, Q. H., et al. A diverse set of microRNAs and microRNA-like small RNAs in developing rice grains. Genome Research. 18 (9), 1456-1465 (2008).
  30. Fahlgren, N., et al. MicroRNA gene evolution in Arabidopsis lyrata and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 22 (4), 1074-1089 (2010).
  31. Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
  32. Blevins, T., et al. Identification of Pol IV and RDR2-dependent precursors of 24 nt siRNAs guiding de novo DNA methylation in Arabidopsis. Elife. 4, 09591 (2015).
  33. Zhai, J., et al. A One Precursor One siRNA Model for Pol IV-Dependent siRNA Biogenesis. Cell. 163 (2), 445-455 (2015).
  34. Werner, S., Wollmann, H., Schneeberger, K., Weigel, D. Structure determinants for accurate processing of miR172a in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 20 (1), 42-48 (2010).
  35. Mateos, J. L., Bologna, N. G., Chorostecki, U., Palatnik, J. F. Identification of microRNA processing determinants by random mutagenesis of Arabidopsis MIR172a precursor. Current Biology. 20 (1), 49-54 (2010).
  36. Vitsios, D. M., et al. Mirnovo: genome-free prediction of microRNAs from small RNA sequencing data and single-cells using decision forests. Nucleic Acids Research. 45 (21), 177 (2017).

Tags

Génétique microARN (miRNA) plante sRNA-seq miRDeep-P2 (miRDP2) Séquençage de nouvelle génération critères miRNA des plantes miRDeep-P (miRDP)
Un pipeline de bioinformatique pour analyser avec précision et efficacité les transcriptomes microARN dans les plantes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Kuang, Z., Li, L., Yang,… More

Wang, Y., Kuang, Z., Li, L., Yang, X. A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants. J. Vis. Exp. (155), e59864, doi:10.3791/59864 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter