Denne artikel skitserer en simpel PCR-baseret analyse til at overvåge aktiviteten af en aktiv linje-1 retroomsætning og til at kort de Novo retrogennem førelser i et givent genom. Ved hjælp af MCF7 Cell line, viser vi heri, hvordan denne metode kan anvendes til at detektere aktivitet af en linje-1 placeret på 22q 12.1.
Lange spækket nukleare elementer 1 (linje-1s) er den eneste familie af mobile genetiske elementer i det menneskelige genom, der kan bevæge sig autonomt. De gør det ved en proces, der kaldes retrogennem førelse, hvori de transskribere til at danne en mRNA-mellemprodukt, som derefter indsættes i genomet ved omvendt transskription. På trods af at være tavs i normale celler, linje-1s er meget aktive i forskellige epiteliale tumorer. De Novo LINE-1 indsættelser kan potentielt drive tumorigenesis, og derfor er det vigtigt at systematisk studere linje-1 retrotransponering i kræft. Ud af ~ 150 retrotransponering-kompetent linje-1s til stede i det menneskelige genom, kun en håndfuld af linje-1 loci, også omtalt som “hot” linje-1s, tegner sig for størstedelen af de Novo line-1 indsættelse i forskellige kræfttyper. Vi har udviklet en simpel polymerase kædereaktion (PCR)-baseret metode til at overvåge retrotransponering aktivitet af disse hot LINE-1s. Denne metode, baseret på langdistance-inverse (LDI)-PCR, udnytter 3 ‘ transduktion, en mekanisme, hvormed en linje-1 mobiliserer sin ledsage ikke-repetitive region, som efterfølgende kan bruges til at identificere de Novo line-1 3 ́ transduktionshændelser stammer fra en bestemt varm linje-1.
Lange spækket nukleare elementer (linje-1s) er en familie af mobile genetiske elementer kaldet retrotransposons, der selvstændigt kan flytte fra et sted til et andet via en Copy-and-paste mekanisme kaldet retrotransponering. Over evolutionær tid, det menneskelige genom har akkumuleret mere end 500.000 kopier af linje-1 gentager1. Men de fleste af de linje 1 eksemplarer, der findes i genomet, er muterede og kan derfor ikke bevæge sig gennem retrogennemførelse; kun ~ 150 kopier har intakt kopi af DNA-sekvens nødvendig for dem at flytte2. I normale somatiske celler er mobiliteten for disse linje-1s begrænset af forskellige værts faktorer3. Disse restriktioner er lettet i forskellige epiteliale tumorer, forårsager linje-1s at være derepresses og resulterer i mange de Novo indsættelser i tumor genom4. Nogle af disse tumor-associerede de Novo indsættelser har vist sig at forårsage af mutagenese i gener, dermed kørsel tumorprogression5,6. Derfor er det vigtigt at være i stand til at kort nye indsættelser i tumor genomet.
Eksisterende metoder til påvisning af de Novo line-1 indsættelser brug (1) hel-genom sekvensering tilgang4,7,8, hvor forskellige beregningsmæssige algoritmer bruges til at finde de Novo line-1 indsættelser fra WGS-data eller (2) næste generations sekvensering, der er rettet mod 3 ‘ ende af unge, potentielt aktive linje-1s9,10,11,12,13. Men at finde nye indsættelser blandt flere tusinde næsten identiske eksemplarer med disse metoder er langt fra trivielt, og udfordringen forværres yderligere af tumor heterogenitet og genomændringer forbundet med LINE-1 indsættelse4.
Undersøgelser ved hjælp af disse eksisterende metoder viste, at blot et par linje-1s tegner sig for størstedelen af de Novo line-1 indsættelser observeret i tumorer7,8. For at svare på, om en bestemt tumorprøve viser linje 1-aktivitet, er det derfor tilstrækkeligt at kort sætte retrotransponerings hændelser forårsaget af denne håndfuld meget aktive linje-1 loci. I denne artikel beskriver vi en simpel polymerase-kædereaktion (PCR)-baseret metode14 , der kan bruges til at overvåge aktiviteten af en bestemt linje-1 locus i den første intron af TTC28 genet på 22q 12.1, der er meget aktiv i kolorektal cancer 7 , 8. denne linje-1 locus vil blive omtalt som TTC28-line-1 i hele artiklen. Denne analyse identificerer specifikt de Novo line-1-retrotransponerings hændelser, der mobiliserer ikke-gentagne sekvenser på 3-flanken-regionen af kildelinjen-1 ved en mekanisme kaldet 3 ́ transduktion15. 3 ́ transduktion opstår på grund af den svage linje-1 polyadenylations signal (pas), der forårsager transkriptional maskineri til at springe den over og i stedet opsige transkriptionen på den stærkere pas downstream, og dermed fange den ledsage ikke-gentagne sekvens ( herefter benævnt “Unique tag”), som derefter indsættes i målet placering sammen med linje-1 sekvens. Philippe et al.16 viste for nylig, at forskellige celletyper kan udtrykke forskellige linje-1 loci. I lyset af denne konstatering, denne metode kan anvendes til at overvåge aktiviteten af de mest udtrykte linje-1, der mobiliserer deres unikke tag i kræfttype interesse.
Det første trin i LDI-PCR er fordøjelsen af genomisk DNA med et restriktionsenzym, der genererer et Begrænsnings fragment, der indeholder den linje-1, der er analyseret (her, TTC28-line-1) og dens unikke tag (figur 1). Fordøjet DNA er derefter cirkuleret af selv-ligation og PCR forstærket ved hjælp af inverse primere placeret inden for den unikke tag. Ved at gøre det, den fulde længde kildelinje-1 på sin “native” placering er altid forstærket og ved siden af det, afkom linje-1 indsættelser på forskellige Target loci indeholder den unikke tag vil også blive forstærket (figur 1), og dermed rapportering den pågældende linje 1.
Her beskriver vi en metode, der kan bruges til at identificere de Novo line-1 indsættelser stammer fra enhver aktiv linje-1 af interesse. Vi har optimeret denne metode til en meget aktiv linje-1, placeret på 22q 12.1, og tidligere viste det at være meget følsom i påvisning sub-Clonal indsættelse i kolorektal cancer14.
LDI-PCR-succesen afhænger af kvaliteten af genomisk DNA. Derfor har vi inkluderet et ekstra kvalitetskontrol trin for at sikre, at der ved protokollens begyndelse findes højmolekyl vægt-DNA (trin 2.1.2). Vi anbefaler at opbevare genomisk DNA ved-20 °C ved langtidsopbevaring og at tilberede aliquoter for at undgå cyklusser med frysning og optøning. Ved hjælp af genomisk DNA fra blod eller patient-matchede normale væv anbefales stærkt at skelne, om den linje-1 retrotransponering opdaget er en kimcelle eller en somatisk begivenhed. Da cut steder for restriktionsenzymer er stokastiske i genomet, er det muligt, at en bestemt de Novo line-1 indsættelse site måske ikke havn nogen cut steder for restriktions enzymet, der anvendes i dets nærhed. Derfor at øge sandsynligheden for påvisning af størstedelen af de Novo line-1 indsættelser i tumor DNA, mere end ét restriktionsenzym bør anvendes i separate reaktioner til at generere forskellige biblioteker af cirkulære DNA-skabelon. Desuden, hvis den unikke tag af LINJEN-1 af interesse har mere end én PAS, derefter ved hjælp af primer par støder op til hver PAS forbedrer chancerne for at opdage stærkt trunkerede transducinger.
Selv om der findes elegante metoder til Genome-dækkende detektion af de Novo line-1-indsættelser, kan de være overvældende, hvis målet er at afprøve en bestemt linje-1 i en specifik cellekontekst. Til dette formål kan LDI-PCR være en billig og enkel, men robust tilgang til at visualisere linje 1-retrotransponerings hændelser. Den målretningsmetode, der anvendes i denne metode, svarer til TS-ATLAS22. LDI-PCR undgår dog at bruge link-oligonukleotider og kan forstærke både 5 og 3 ‘-kryds af de Novo line-1-indsætningen samtidigt. Oplysninger om både 5-og 3-vejkryds af linje 1-indsættelse, destinationsstedet for integration, polyA-hale og ændringer på målstedet, som alle er kendetegnende for linje 1-retrogennemførelse, kan opnås ved at koble LDI-PCR med et enkelt molekyle lang læse sekvensering teknologier. Lange læsninger således genereret indeholder den indsatte linje-1 sekvens, dens unikke tag og målsekvenser i en enkelt læse, omgåelse vanskeligheder med kort læsninger i den repetitive region.
Der er to store begrænsninger ved at bruge LDI-PCR til påvisning af linje 1-aktivitet. Den første er iboende til PCR: det kan kun pålideligt forstærke fragmenter op til 10 KB i størrelse. Dette bør overvejes, når der vælges begrænsnings enzym (er), da det oprindelige fragment ikke bør overskride denne grænse. For det andet, denne metode kan kun afsløre retrotransponering begivenheder, der mobiliserer linje-1’s 3 ́ ledsage region ved 3 ́ transducinger. Derfor, aktivitet af disse linje-1s, der ikke udviser 3 ́ transduktion vil ikke blive opdaget ved hjælp af denne metode. På trods af at det forstærkes af LDI-PCR, kan nogle linje-1-retrotransponerings hændelser, der (a) genererer et PCR-mål af samme størrelse som “native”-placeringen eller andre retrogennemførelsespositioner eller (b) er sjældne eller subklonale, ikke påvises af agrose gel Elektroforese. Sådanne linje-1-retrotransponerings hændelser kan registreres ved at sekvense LDI-PCR-produktet ved hjælp af et enkelt molekyle lang læse sekvensering af teknologier14.
Arbejdsprocessen, der er beskrevet her, kan let ændres for at registrere aktiviteten af andre “hot” line-1s ved hjælp af et egnet begrænsnings enzym og ved at designe inverse primere, der er målrettet mod disse linje-1s. Ud over påvisning af linje 1-medieret 3 ́-transduktion kan denne metode tilpasses til at detektere mindre hyppige linje 1-medierede 5 ́-transducinger23. Lignende metode er blevet brugt til at identificere integrationen site af LINE-1 reportere i celle-baserede assays24 og proviral integration sites i Cancer25. Udover linje-1 indsættelser, denne metode kan også udnyttes til at opdage andre genomiske aberrationer, såsom DNA rearrangeringer, hvor oplysninger om omorganisering-tilbøjelige region præ-eksisterer26.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke alle vores medforfattere i artiklen, hvor denne metode blev først beskrevet14, især Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara og ESA Pitkänen for værdifulde diskussioner under udviklingen af metoden. L.K. er finansieret af Finlands Akademi (tilskudsnummer 25996, 292789, 306026 og 314394), Sigrid Juselius Foundation og det finske Cancer selskab. B.P. er modtager af universitetet i Helsinki Research Foundation ph. d. Studentship, en finsk Cancer Society afhandling Grant, og en doktor forskning tilskud fra Ida Montinin Säätiö. Vi takker også Teemu Masalin (University of Helsinki) og kul Shrestha fra L.K. forskergruppe for at hjælpe os med video produktion.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |