Este artigo esboça um ensaio PCR-baseado simples para monitorar a atividade de um Retrotransposão linha-1 ativo e para mapear retrotransposições de de novo em um genoma dado. Usando a linha celular MCF7, demonstramos aqui como esse método pode ser aplicado para detectar a atividade de uma linha-1 localizada em 22q 12.1.
Os elementos nucleares intercaladas longos 1 (linha-1s) são a única família de elementos genéticos móveis no genoma humano que pode se mover autonomamente. Eles fazem isso por um processo chamado retrotransposição em que transcripta para formar um intermediário mRNA que é então, consequentemente, inserido no genoma por transcrição reversa. Apesar de ser silencioso em células normais, a linha-1s é altamente ativa em diferentes tumores epiteliais. De novo As inserções LINE-1 podem potencialmente conduzir a tumorigênese e, portanto, é importante estudar sistematicamente a retrotransposição da linha 1 no câncer. Fora de ~ 150 retrotransposição-competente linha-1s presente no genoma humano, apenas um punhado de linha-1 loci, também referido como “quente” linha-1s, conta para a maioria de de novo line-1 inserção em diferentes tipos de câncer. Nós desenvolvemos um método simples da reacção em cadeia do polymerase (PCR)-based para monitorar a atividade do retrotransposição destes linha-1s quente. Esse método, baseado no inverso de longa distância (LDI)-PCR, aproveita a transdução de 3 ́, mecanismo pelo qual uma linha-1 mobiliza sua região não repetitiva flanqueada, que pode ser usada posteriormente para identificar eventos de transdução de linha-1 3 ́ de novo proveniente de uma linha quente particular-1.
Os elementos nucleares intercaladas longos (linha-1s) são uma família de elementos genéticos móveis chamados retrotransposons que podem independentemente mover-se de um lugar a outro através de um mecanismo da copiar-e-pasta chamado retrotransposição. Durante o tempo evolutivo, o genoma humano acumulou mais de 500.000 cópias de repetições delinha 1. No entanto, a maioria das cópias da linha 1 presentes no genoma são mutadas e, portanto, não podem se mover via retrotransposição; somente ~ 150 cópias têm a cópia intata da seqüência do ADN necessária para que movam2. Em células somáticas normais, a mobilidade destes linha-1s é restrita por diferentes fatores hospedeiros3. Estas limitações são aliviadas em tumores epithelial diferentes, fazendo com que a linha-1s seja com e tendo por resultado muitas inserções de de novo no genoma4do tumor. Algumas destas inserções tumor-associadas de de novo foram mostradas para causar a mutagenese do insertional nos genes, daqui conduzindo a progressão do tumor5,6. Portanto, é importante ser capaz de mapear novas inserções no genoma tumoral.
Métodos existentes para detectar o uso da linha-1 das inserções de de novo (1) aproximação de sequenciamento do genoma inteiro4,7,8, onde os algoritmos computacionais diferentes são usados para encontrar a linha-1 inserções de de novo de dados WGS, ou (2) seqüenciamento de próxima geração que tem como alvo o final 3 ́ de jovens, potencialmente ativos linha-1s9,10,11,12,13. No entanto, encontrar novas inserções entre vários milhares de cópias Near-idênticos com esses métodos está longe de ser trivial, e o desafio é ainda mais agravado pela heterogeneidade tumoral e alterações genómicas associadas à inserção da linha 14.
Estudos que utilizam esses métodos existentes mostraram que apenas alguns linha-1s conta para a maioria das inserções de linha-1 de de novo observadas nos tumores7,8. Conseqüentemente, para responder se ou não uma amostra particular do tumor indica a atividade da linha-1, é suficiente mapear eventos do retrotransposição causados por este punhado de loci linha-1 altamente ativo. Neste artigo, nós descrevemos um método simples da reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseado14 que possa ser usado para monitorar a atividade de um locus específico da linha-1 no primeiro intron do gene TTC28 em 22q 12.1 que é altamente-ativo no cancro colorretal 7 anos de , 8. este Locus line-1 será referido como TTC28-line-1 em todo o artigo. Este ensaio identifica especificamente os eventos de retrotransposição de linha-1 de novo que mobilizam a sequência não repetitiva na região de flanquear 3 ́ da linha-1 de origem por um mecanismo denominado transdução de 3 ́15. a transdução 3 ́ ocorre devido ao fraco sinal de poliadenilação LINE-1 (PAS) que faz com que a maquinaria transcricional o ignore e, em vez disso, termine a transcrição no PAS mais forte a jusante, capturando assim a sequência não repetitiva ( doravante referida como a “marca exclusiva”) que é então inserida no local de destino ao lado da seqüência de linha 1. Philippe et al.16 mostraram recentemente que diferentes tipos de células podem expressar diferentes Locos line-1. À luz deste achado, este método pode ser aplicado para monitorar a atividade do mais altamente expressado linha-1 que mobilizam sua Tag original no tipo de câncer de interesse.
O primeiro passo na LDI-PCR é a digestão do DNA genómico com uma enzima de restrição que gera um fragmento de restrição contendo a linha-1 sendo ensaiada (aqui, TTC28-line-1) e sua tag exclusiva (Figura 1). O DNA digerido é então circularizado por autoligadura e PCR amplificado usando primers inversos localizados dentro da tag exclusiva. Ao fazer isso, a fonte de comprimento total LINE-1 em seu local “nativo” é sempre amplificada e ao lado dela, as inserções LINE-1 de descendentes em diferentes loci-alvo contendo a marca exclusiva também serão amplificadas (Figura 1), relatando assim a atividade de retrotransposição da linha-1 em questão.
Aqui nós descrevemos um método que possa ser usado para identificar as inserções da linha-1 de de novo que resultam de toda a linha-1 ativa de interesse. Otimizamos este método para uma linha-1 altamente ativa, localizada em 22q 12.1, e previamente demonstrou ser altamente sensível na detecção de inserções subclonais no câncer colorretal14.
O sucesso da LDI-PCR depende da qualidade do DNA genómico. Conseqüentemente, nós incluímos uma etapa adicional do controle da qualidade para assegurar-se de que no começo do protocolo, o ADN high-molecular do peso esteja atual (etapa 2.1.2). Nós recomendamos armazenar o ADN genomic em-20 ° c para o armazenamento a longo prazo, e para preparar alíquotas a fim evitar ciclos de congelação e de thawing. Usar o ADN genomic do sangue ou do tecido normal paciente-combinado é altamente-recomendado distinguir se a linha-1 retrotransposição detectada é um germline ou um evento somático. Desde que os locais cortados para enzimas da limitação são estocásticos no genoma, é possível que um local particular da inserção line-1 de de novo não possa abrigar nenhuns locais cortados para a enzima da limitação que está sendo usada em sua vizinhança. Daqui para aumentar a probabilidade de detectar a maioria de inserções da linha-1 de de novo no ADN do tumor, mais de uma enzima da limitação deve ser usada em reações separadas para gerar bibliotecas diferentes do molde circular do ADN. Além disso, se a tag exclusiva da linha-1 de interesse tem mais de um PAS, em seguida, usando primer pares adjacentes a cada PAS melhora as chances de detectar transacionações fortemente truncados.
Embora os métodos elegantes para a deteção genoma-larga de inserções da linha-1 de de novo existam, podem ser esmagadores se o alvo é sondar a competência do retrotransposição de uma linha-1 particular em um contexto celular específico. Para esta finalidade, LDI-PCR pode ser uma aproximação barata e simples contudo robusta para visualizar a linha-1 eventos do retrotransposição. A abordagem de segmentação utilizada neste método é semelhante ao TS-ATLAS22; no entanto, a LDI-PCR evita o uso de oligonucleotídeos do vinculador e pode amplificar as junções 5 ́ e 3 ́ da inserção de de novo line-1 simultaneamente. As informações relativas às junções 5 ́ e 3 ́ da inserção LINE-1, ao local de integração, à cauda de polyA e às modificações no local de destino, todas as quais são marcas de linha-1 retrotransposição, podem ser obtidas através do acoplamento LDI-PCR com uma molécula única tecnologias de sequenciamento de leitura longa. Leituras longas assim geradas contêm a seqüência de linha-1 inserida, sua marca exclusiva e as sequências de destino em uma única leitura, contornando dificuldades de mapeamento de leituras curtas na região repetitiva.
Há duas limitações principais a usar o LDI-PCR para a deteção da atividade LINE-1. O primeiro é inerente ao PCR: pode somente confiantemente amplificar fragmentos até 10 KB no tamanho. Isto deve ser considerado ao selecionar enzima (s) da restrição, porque o fragmento nativo não deve exceder este limite. Em segundo lugar, este método só pode detectar eventos de retrotransposição que mobilizam a região de flanqueamento de 3 ́ da linha 1 por três ́ transsecções. Portanto, a atividade desses linha-1s que não exibem a transdução 3 ́ não será detectada usando esse método. Adicionalmente, apesar de ser amplificado por LDI-PCR, alguns eventos de retrotransposição LINE-1 que (a) geram um alvo do PCR do tamanho similar como a posição “nativa” ou outras retrotransposições ou (b) são raros ou subclonal, não podem ser detectados pelo gel do agarose Electroforese. Esses eventos de retrotransposição de linha 1 podem ser capturados por sequenciamento do produto LDI-PCR usando tecnologias de sequenciamento de leitura longa de molécula única14.
O fluxo de trabalho descrito aqui pode ser facilmente modificado para detectar a atividade de outros “Hot” LINE-1s usando uma enzima de restrição adequada e projetando iniciadores inversos direcionados a esses linha-1s. Além da detecção da transdução de 3 ́ mediada pela linha-1, esse método pode ser adaptado para detectar Duções de 5 ́ mediadas por linha 1 menos freqüentes23. O método similar foi usado para identificar o local da integração de repórteres da linha-1 em ensaios Cell-Based24 e em locais da integração de proviral no cancro25. Além das inserções da linha 1, esse método também pode ser utilizado para detectar outras aberrações genómicas, como rearranjos de DNA, onde a informação sobre a região propensa a rearranjo pré-existente26.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a todos os nossos coautores no artigo onde este método foi descrito pela primeira vez14, especialmente Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara e ESA Pitkänen para discussões valiosas ao desenvolver o método. L.K. é financiado pela Academia da Finlândia (números de subvenção 25996, 292789, 306026 e 314394), a Fundação Sigrid Juselius, e da sociedade finlandesa de câncer. B.P. é beneficiária da Universidade de Helsinki Research Foundation PhD Studentship, uma bolsa de estudos da sociedade finlandesa do câncer, e uma bolsa de doutorado de ida Montinin Säätiö. Agradecemos também Teemu Masalin (Universidade de Helsínquia) e Kul Shrestha do grupo de pesquisa da L.K. para nos ajudar com a produção de vídeo.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |