Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

Summary

Forudsat her er en protokol til at undersøge samspillet mellem Native form, prefibrillar, og modne amyloid fibriller af forskellige peptider og proteiner med mitokondrier isoleret fra forskellige væv og forskellige områder af hjernen.

Abstract

En voksende mængde af beviser indikerer, at membran permeabilisering, herunder interne membraner såsom mitokondrier, er et fælles træk og primære mekanisme af amyloid aggregat-induceret toksicitet i neurodegenerative sygdomme. Men de fleste rapporter, der beskriver mekanismerne for membran afbrydelse er baseret på phospholipid modelsystemer, og undersøgelser direkte rettet mod hændelser, der forekommer på niveauet af biologiske membraner er sjældne. Beskrevet her er en model til undersøgelse af mekanismerne for amyloid toksicitet på membran niveau. For mitokondriel isolering anvendes tæthed gradient medium til at opnå præparater med minimal myelin forurening. Efter bekræftelse af mitokondriel membran integritet er samspillet mellem amyloid fibriller, der hidrører fra α-synuclein, bovin insulin, og høne æggehvide lysozym (hewl) med rotte hjernen mitokondrier, som en in vitro biologisk model, undersøgt. Resultaterne viser, at behandling af hjernen mitokondrier med fibrillar forsamlinger kan forårsage forskellige grader af membran permeabilization og ROS indhold ekstraudstyr. Dette indikerer struktur afhængige interaktioner mellem amyloid fibriller og mitokondriel membran. Det foreslås, at biofysiske egenskaber af amyloid fibriller og deres specifikke binding til mitokondrielle membraner kan give forklaringer på nogle af disse observationer.

Introduction

Amyloid-relaterede lidelser, kendt som amyloidoser, udgør en stor gruppe af sygdomme defineret ved fremkomsten af uopløselige protein aflejringer i forskellige væv og organer^1,2. Blandt dem er neurodegenerative lidelser de hyppigst anvendte former, hvor protein aggregater optræder i det centrale eller perifere nervesystem². Selv om en række mekanismer er blevet foreslået at være involveret i toksiciteten af amyloid aggregater³, en voksende mængde af beviser peger på celle membran afbrydelse og permeabilisering som den primære mekanisme af amyloid patologi^{4, 5}. Ud over plasma membran, interne organeller (dvs., mitochondrier) kan også blive påvirket.

Interessant, nye beviser tyder på, at mitokondriel dysfunktion spiller en afgørende rolle i patogenesen af neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers og Parkinsons sygdomme^6,7. I overensstemmelse med dette spørgsmål har talrige rapporter indikeret binding og akkumulering af amyloid β-peptid, α-synuclein, huntingtin og Als-sammenkædede mutant SOD1 proteiner til mitokondrier^{8,9,10, 11}. mekanismen for membran permeabilisering ved amyloid aggregater menes at forekomme enten gennem dannelse af diskrete kanaler (porer) og/eller gennem en ikke-specifik vaskemiddel lignende mekanisme^{5,12, 13}. Det er bemærkelsesværdigt, at de fleste af disse konklusioner har været baseret på rapporter, der involverer phospholipid modelsystemer, og undersøgelser direkte rettet mod de hændelser, der forekommer i biologiske membraner er sjældne. Det er klart, disse kunstige lipid dobbeltlag ikke nødvendigvis afspejler de iboende egenskaber af biologiske membraner, herunder de af mitokondrier, som er heterogene strukturer og består af en bred vifte af phospholipider og proteiner.

I nærværende undersøgelse anvendes mitokondrier isoleret fra rotte hjerner som en in vitro biologisk model til at undersøge de ødelæggende virkninger af amyloid fibriller, der opstår som følge af α-synuclein (som et monomer protein), bovin insulin (som et model peptid, som viser signifikant strukturel homologi med humant insulin involveret i injektion-lokaliseret amyloidose), og høne æggehvide lysozym (HEWL; som en fælles model protein til undersøgelse af amyloid sammenlægning). Interaktioner og mulige skader af mitokondrie membraner induceret af amyloid fibriller er derefter undersøgt ved at observere frigivelsen af mitokondrie Malate dehydrogenase (MDH) (placeret i mitokondrie matrix) og mitokondrier reaktiv ilt art (ROS) ekstraudstyr.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den institutionelle dyrepleje og brug Komité (IACUC) af medicinske videnskaber på Teheran Universitet. Der blev gjort en maksimal indsats for at minimere lidelser og skadelige virkninger for rotterne ved at skærpe guillotine bladene og anvende knivene resolut og hurtigt. 1. hjernens homogenisering og mitokondriel isolation Bemærk: alle reagenser til mitokondriel isolation blev udarbejdet i henhold til Sims og An…

Representative Results

Protokollen beskriver en model til at studere interaktioner af amyloid og med rotte hjernen mitokondrier som en in vitro biologisk model. For mitokondriel præparat, 15% (v/v) tæthed gradient medium blev brugt til at fjerne myelin som større forurening af hjernevæv14. Som vist i figur 1aproducerede centrifugering ved 30.700 x g to særskilte materiale bånd, myelin (som den vigtigste bestanddel af band 1) og band 2, so…

Discussion

Et væld af eksperimentelle resultater understøtter hypotesen om, at cytotoksicitet af fibrillar aggregater er væsentligt forbundet med deres evne til at interagere med og permeabilize biologiske membraner^4,5. Men de fleste af dataene er baseret på kunstige lipid-dobbeltlag, der ikke nødvendigvis afspejler de iboende egenskaber af biologiske membraner, som er heterogene strukturer med en bred vifte af phospholipider og proteiner. Her, ved hjælp af hjernen mi…

Materials

2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate	Sigma	35845
Ammonium sulfate	Merck	1012171000
Black 96-well plate	Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate	Corning
Bovine insulin	Sigma	I6634
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A2153
BSA essentially fatty acid-free	Sigma	A6003
Centrifuge	Sigma
Crystal clear sealing tape	Corning
CuSO4	Sigma	451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa)	Sigma	D2272
Dounce homogenizer	Potter Elvehjem
EDTA	Sigma	E9884
Fluorescence plate reader	BioTek
Fluorescence spectrophotometer	Cary Eclipse VARIAN
Folin	Merck	F9252
Glycine	Sigma	G7126
Guillotine	Made in Iran
HCl	Merck	H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL)	Sigma	L6876
Na2CO3	Sigma	S7795
NaH2PO4	Sigma	S7907
NaOH	Merck	S8045
Oxaloacetate	Sigma	O4126
Percoll	GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma	CS0030
PMSF	Sigma	P7626
Potassium sodium tartrate	Sigma	217255
Quartz cuvette	Sigma
Spectrophotometer	analytik jena	SPEKOL 2000 model
Succinate	Sigma	S2378
Sucrose	Merck	1076871000
Thermomixer	Eppendorph
Thioflavin T	Sigma	T3516
Tris-HCl	Merck	1082191000
Triton X-100	Sigma	T9284
Tryptone	QUELAB
Water bath	Memmert
Yeast Extract	QUELAB
β-NADH	Sigma	N8129