Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides
Summary
Fornecido aqui é um protocolo para investigar as interações entre a forma nativa, prefibrillar, e fibrilas amiloides maduras de diferentes peptídeos e proteínas com mitocôndrias isoladas de diferentes tecidos e várias áreas do cérebro.
Abstract
Um corpo de evidência crescente indica que a permeabilização da membrana, incluindo as membranas internas tais como a mitocôndria, é uma característica comum e um mecanismo preliminar da toxicidade agregado-induzida amilóide em doenças neurodegenerativas. Entretanto, a maioria de relatórios que descrevem os mecanismos do rompimento da membrana são baseados em sistemas modelo do fosfolipídeo, e os estudos que alvejam diretamente os eventos que ocorrem no nível de membranas biológicas são raros. É descrito aqui um modelo para estudar os mecanismos da toxicidade do amilóide a nível da membrana. Para a isolação mitochondrial, o meio do inclinação da densidade é usado para obter preparações com contaminação mínima do mielina. Após a confirmação da integridade da membrana mitocondrial, é investigada a interação de fibrilas amilóides decorrentes de α-synucleina, insulina bovina e lisozima branca de ovo de galinha (HEWL) com mitocôndrias cerebrais de ratos, como modelo biológico in vitro. Os resultados demonstram que o tratamento de mitocôndrias cerebrais com conjuntos fibrilares pode causar diferentes graus de permeabilização da membrana e aprimoramento do conteúdo de Eros. Isto indica interações estrutura-dependentes entre fibrilas do amilóide e membrana mitochondrial. Sugere-se que as propriedades biofísicas das fibrilas amilóides e sua ligação específica às membranas mitocondriais possam fornecer explicações para algumas dessas observações.
Introduction
Transtornos relacionados ao amiloide, conhecidos como amiloiidoses, constituem um grande grupo de doenças definidas pelo surgimento de depósitos proteicos insolúveis em diferentes tecidos e órgãos1,2. Dentre eles, as desordens neurodegenerativas são as formas mais freqüentes em que os agregados proteicos aparecem no sistema nervoso central ou periférico2. Embora vários mecanismos tenham sido propostos para estarem envolvidos na toxicidade dos agregados amilóides3, um corpo crescente de evidências aponta para o rompimento da membrana celular e a permeabilização como o mecanismo primário da patologia amilóide4, a 5. Além da membrana plasmática, as organelas internas (ou seja, mitocôndrias) também podem ser afetadas.
Curiosamente, evidências emergentes sugerem que a disfunção mitocondrial desempenha um papel crítico na patogênese de distúrbios neurodegenerativos, incluindo a doença de Alzheimer e de Parkinson6,7. De acordo com essa questão, inúmeros relatos indicaram ligação e acúmulo de proteínas de peptídeo amilóide, α-sinucleina, huntingtina e SOD1 com as mitocôndrias8,9,10, 11. pensa-se que o mecanismo de permeabilização da membrana por agregados amiloides ocorra através da formação de canais discretos (poros) e/ou através de um mecanismo de detergente não específico5,12, trezeanos. Destaca-se que a maioria dessas conclusões tem sido baseada em relatos envolvendo sistemas de modelo fosfolipídeo, e estudos direcionados diretamente aos eventos que ocorrem nas membranas biológicas são raros. Claramente, esses bicamadas lipídico artificial não refletem necessariamente as propriedades intrínsecas das membranas biológicas, incluindo as das mitocôndrias, que são estruturas heterogêneas e compostas por uma grande variedade de fosfolipídios e proteínas.
No presente estudo, as mitocôndrias isoladas de cérebros de ratos são utilizadas como um modelo biológico in vitro para examinar os efeitos destrutivos das fibrilas amilóides decorrentes da α-sinucleina (como uma proteína amiloidogênica), a insulina bovina (como um peptídeo modelo mostrando homologia estrutural significativo com o insulin humano envolvido no amyloidosis injeção-localizado), e o lisozima branco do ovo de galinha (Hewl; como uma proteína modelo comum para o estudo da agregação do amilóide). As interações e possíveis danos das membranas mitocondriais induzidas por fibrilas amilóides são então investigadas observando-se a liberação de malato mitocondrial desidrogenase (MDH) (localizada na matriz mitocondrial) e de oxigênio reativo das mitocôndrias melhoramento de espécies (ROS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma riqueza de resultados experimentais sustenta a hipótese de que a citotoxicidade dos agregados fibrilares está significativamente associada à sua capacidade de interagir e permeabilizar as membranas biológicas4,5. No entanto, a maioria dos dados são baseados em bicamadas lipídico artificial que não refletem necessariamente as propriedades intrínsecas das membranas biológicas, que são estruturas heterogêneas com uma grande variedade de fosfolipídios…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Conselho de pesquisa do Instituto de estudos avançados em ciências básicas (IASBS), Zanjan, Irã.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
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