아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화
Summary
여기에 제공된 것은 다른 조직과 뇌의 다양한 영역에서 분리된 미토콘드리아를 가진 다른 펩티드 및 단백질의 네이티브 형태, 프리피릴라 및 성숙한 아밀로이드 섬유사이의 상호작용을 조사하기 위한 프로토콜이다.
Abstract
증거의 성장 몸은 미토콘드리아와 같은 내부 막을 포함하여 막 관전이 신경 퇴행성 질환에서 아밀로이드 골재 유발 독성의 일반적인 특징및 1 차적인 메커니즘임을 나타냅니다. 그러나, 막 중단의 기계장치를 기술하는 대부분의 보고는 인지질 모형 시스템에 근거를 두고, 생물학 막의 수준에서 생기는 사건을 직접 표적으로 하는 연구 결과는 드뭅니다. 여기서 설명된 것은 막 수준에서 아밀로이드 독성의 메커니즘을 연구하기 위한 모델이다. 미토콘드리아 절연의 경우 밀도 구배 매미가 최소한의 미엘린 오염으로 제제를 얻는 데 사용됩니다. 미토콘드리아 막 무결성 확인 후, α-synuclein, 소 인슐린 및 암탉 계란 흰자 리소자임(HEWL)과 쥐 뇌 미토콘드리아에서 발생하는 아밀로이드 섬유소의 상호작용이 시험관내 생물학적 모델로서 조사된다. 결과는 섬유결집성으로 뇌 미토콘드리아를 치료하면 막 투과및 ROS 함량 향상의 다른 정도를 유발할 수 있음을 보여줍니다. 이것은 아밀로이드 섬유와 미토콘드리아 막 사이 구조 의존적인 상호 작용을 나타냅니다. 아밀로이드 섬유소의 생물학적 특성과 미토콘드리아 막에 대한 특정 결합이 이러한 관찰중 일부에 대한 설명을 제공할 수 있다고 제안됩니다.
Introduction
아밀로이드 관련 장애, 아밀로이드 로 알려진, 다른 조직과 장기에 불용성 단백질 예금의 출현에 의해 정의 된 질병의 큰 그룹을 구성1,2. 그 중, 신경 퇴행성 질환은 단백질 응집체가 중추 또는 말초 신경계에 나타나는 가장 빈번한 형태이다2. 아밀로이드 골재의 독성에 관여하는 다수의 기제가 제안되었지만3,세포막 파괴 및 투과를 아밀로이드 병리학의 1차 기전으로 가리키는 증거가 증가하고 있다4, 5. 혈장 막 이외에, 내부 세포기관 (즉, 미토콘드리아)도 영향을받을 수 있습니다.
흥미롭게도, 새로운 증거는 미토콘드리아 기능 장애가 알츠하이머병및 파킨슨병을 포함한 퇴행성 신경 질환의 발병기전에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다6,7. 이 문제에 따라, 수많은 보고서는 미토콘드리아8,9,10에아밀로이드 β-펩티드, α-synuclein, 헌팅틴 및 ALS 연결 돌연변이 SOD1 단백질의 결합 및 축적을나타냈다. 11. 아밀로이드 응집체에 의한 막 투과 메커니즘은 이산 채널 (모공)의 형성 및 / 또는 비특이적 세제와 같은메커니즘을통해 발생하는 것으로 생각된다5,12, 13. 이러한 결론의 대부분은 인지질 모델 시스템을 포함 하는 보고서에 근거 되었습니다 주목할 만, 그리고 직접 생물학적 막에서 발생 하는 이벤트를 대상으로 하는 연구는 드문. 분명히, 이러한 인공 지질 이중층은 반드시 이질적인 구조이고 다양한 인지질 및 단백질로 구성된 미토콘드리아를 포함한 생물학적 막의 본질적인 특성을 반영하지는 않는다.
본 연구에서, 쥐 뇌로부터 분리된 미토콘드리아는 α-synuclein(아밀로이드 단백질), 소 인슐린(모델 펩타이드로 서 식)에서 발생하는 아밀로이드 섬유소의 파괴적인 효과를 조사하기 위해 시험관내 생물학적 모델로 사용된다. 주사 국소화 된 아밀로이드증에 관여하는 인간 인슐린과 중요한 구조적 상동성, 및 암탉 계란 흰자 리소자임 (HEWL; 아밀로이드 응집 연구를위한 일반적인 모델 단백질). 아밀로이드 섬유소에 의해 유도된 미토콘드리아 막의 상호 작용 및 가능한 손상은 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소(MDH)(미토콘드리아 매트릭스에 위치)와 미토콘드리아 반응성 산소의 방출을 관찰함으로써 조사됩니다. 종 (ROS) 향상.
Protocol
모든 동물 실험은 테헤란 대학의 의학 의학기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 수행되었다. 기요틴 블레이드를 선명하게 하고 칼날의 단호하고 신속한 움직임을 적용하여 쥐의 고통과 해로운 영향을 최소화하기 위해 최대노력을 기울였습니다. 1. 뇌 균질화 및 미토콘드리아 분리 참고 : 미토 콘 드리 아 절연을위한 모든 시약은 심즈 앤더슨<sup class…
Representative Results
프로토콜은 시험관 내 생물학적 모델로서 쥐 뇌 미토콘드리아와 아밀로이드 섬유의 상호 작용을 연구하기위한 모델을 설명합니다. 미토콘드리아 제제의 경우, 15% (v/v) 밀도 그라데이션 배지를 사용하여 뇌 조직의 주요 오염물질로서 미엘린을제거하였다 14. 그림 1A에도시된 바와 같이, 30,700 x g의 원심분리는 농축된 미토콘드리아 분획을 포함하는 두 …
Discussion
풍부한 실험 결과는 세브릴라 응집체의 세포 독성이 생물학적 막과 상호 작용하고 투과하는 능력과 유의하게 연관되어 있다는 가설을 뒷받침합니다4,5. 그러나, 대부분의 데이터는 반드시 다양한 인지질 및 단백질을 가진 이기종 구조인 생물학적 막의 본질적인 특성을 반영하지 않는 인공 지질 이중층을 기반으로 합니다. 여기서, 뇌 미토콘드리아를 시…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 기본 과학 연구소 (IASBS), 잔잔, 이란의 연구위원회의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
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Cite This Article
Zadali, R., Ghareghozloo, E. R., Ramezani, M., Hassani, V., Rafiei, Y., Chiyaneh, S. M., Meratan, A. A. Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils. J. Vis. Exp. (151), e59883, doi:10.3791/59883 (2019).