एमीलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा मस्तिष्क माइटोकोंड्रिया के साथ और झिल्ली permeabilization के साथ बातचीत
Summary
लेकिन यहाँ देशी फार्म के बीच बातचीत की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल है, prefibrillar, और विभिन्न पेप्टाइड्स और प्रोटीन के परिपक्व एमिलॉयड फाइब्रिल्स के साथ mitochondria विभिन्न ऊतकों और मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों से अलग.
Abstract
सबूत के एक बढ़ते शरीर इंगित करता है कि झिल्ली permeabilization, mitochondria जैसे आंतरिक झिल्ली सहित, एक आम विशेषता है और neurodegenerative रोगों में एमिलॉयड कुल प्रेरित विषाक्तता के प्राथमिक तंत्र है. हालांकि, झिल्ली व्यवधान के तंत्र का वर्णन सबसे रिपोर्ट फॉस्फोलिपिड मॉडल सिस्टम पर आधारित हैं, और अध्ययन सीधे जैविक झिल्ली के स्तर पर होने वाली घटनाओं को लक्षित दुर्लभ हैं. यहाँ वर्णित झिल्ली के स्तर पर एमिलॉयड विषाक्तता के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल है. Mitochondrial अलगाव के लिए, घनत्व ढाल मध्यम न्यूनतम myelin संदूषण के साथ तैयारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. माइटोकोंड्रिल झिल्ली अखंडता की पुष्टि के बाद, एमिलॉयड फाइब्रिल की बातचीत जेड-साइनुक्लिइन, गोजातीय इंसुलिन, और मुर्गी अंडे सफेद lysozyme (HEWL) चूहे मस्तिष्क mitochondria के साथ से उत्पन्न होने वाली, एक इन विट्रो जैविक मॉडल के रूप में, जांच की है। परिणाम प्रदर्शित करता है कि फाइब्रिलर विधानसभाओं के साथ मस्तिष्क mitochondria के उपचार झिल्ली permeabilization और ROS सामग्री वृद्धि के विभिन्न डिग्री पैदा कर सकता है. यह एमिलॉयड फाइब्रिल्स और माइटोकोंड्रिल झिल्ली के बीच संरचना-निर्भर अन्योन्यक्रिया को इंगित करता है। यह सुझाव दिया जाता है कि एमिलॉयड फाइब्रिल्स के जैवभौतिक गुण और माइटोकोंड्रिल झिल्ली के लिए उनकी विशिष्ट बाइंडिंग इन प्रेक्षणों में से कुछ के लिए स्पष्टीकरण प्रदान कर सकती है।
Introduction
एमिलॉयड से संबंधित विकार, जिसे एमिलॉयडोस के रूप में जाना जाता है, विभिन्न ऊतकों और अंगों में अघुलनशील प्रोटीन जमा की उपस्थिति द्वारा परिभाषित रोगों का एक बड़ा समूह का गठन1,2. उनमें से, neurodegenerative विकार सबसे अक्सर रूपों में जो प्रोटीन समुच्चय केंद्रीय या परिधीय तंत्रिका तंत्र2में दिखाई देते हैं. हालांकि एमिलॉयड समुच्चय3की विषाक्तता में शामिल होने के लिए कई तंत्रों का प्रस्ताव किया गया है , एमिलॉयड पैथोलॉजी4के प्राथमिक तंत्र के रूप में कोशिका झिल्ली विघटन और permebilization के लिए सबूत की बढ़ती शरीर, 5. प्लाज्मा झिल्ली के अलावा, आंतरिक organelles (यानी, mitochondria) भी प्रभावित हो सकता है.
दिलचस्प है, उभरते सबूत पता चलता है कि mitochondrial रोग neurodegenerative विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, अल्जाइमर और पार्किंसंस रोगों सहित6,7. इस मुद्दे के अनुसार, कई रिपोर्टों ने एमिलॉयड जेड-पेप्टाइड, जेड-सिनयूक्लिइन, हंटिंगटिन, और एएलएस से जुड़े उत्परिवर्ती SOD1 प्रोटीन के बंधन और संचय को माइटोकोंड्रिया8,9,10, 11.एमिलॉयड समुच्चय द्वारा झिल्ली परमीबिलाइजेशन की क्रियाविधि या तो असतत चैनलों के गठन के माध्यम से माना जाता है (पोर) और/या एक गैर विशिष्ट डिटर्जेंट की तरह तंत्र के माध्यम से5,12, 13. यह उल्लेखनीय है कि इन निष्कर्षों के अधिकांश फॉस्फोलिपिड मॉडल सिस्टम से जुड़े रिपोर्ट पर आधारित किया गया है, और अध्ययन सीधे जैविक झिल्ली में होने वाली घटनाओं को लक्षित दुर्लभ हैं. जाहिर है, इन कृत्रिम लिपिड bilayers जरूरी जैविक झिल्ली के आंतरिक गुणों को प्रतिबिंबित नहीं, mitochondria के उन सहित, जो विषम संरचनाओं रहे हैं और फॉस्फोलिपिड और प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता से बना.
वर्तमान अध्ययन में, mitochondria चूहे दिमाग से अलग एक इन विट्रो जैविक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है के लिए amyloid फाइब्रिल्स के विनाशकारी प्रभाव की जांच करने के लिए जेड-synuclein से उत्पन्न होने वाले (एक एमिलॉयडप्रोटीन प्रोटीन के रूप में), गोजातीय इंसुलिन (एक मॉडल पेप्टाइड दिखा के रूप में) इंजेक्शन-स्थानीयकृत एमिलॉयडोसिस में शामिल मानव इंसुलिन के साथ महत्वपूर्ण संरचनात्मक होमोलोजी, और मुर्गी अंडे सफेद लाइसोजाइम (HEWL; एमिलॉयड एकत्रीकरण के अध्ययन के लिए एक आम मॉडल प्रोटीन के रूप में)। एमिलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा प्रेरित माइटोकोंड्रियाल झिल्ली की बातचीत और संभावित क्षति की जांच माइटोकोंड्रियाल मैलेट डिहाइड्रोजेनेज (एमडीएच) (माइटोकोंड्रिल मैट्रिक्स में स्थित) और माइटोकोंड्रिया रिएक्टिव ऑक्सीजन की रिहाई को देखकर की जाती है। प्रजातियों (आरओएस) वृद्धि।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रायोगिक परिणामों का धन इस परिकल्पना का समर्थन करता है कि फाइब्रिलर समुच्चयों की साइटोटॉक्सिसिटी जैविक झिल्ली4,5के साथ बातचीत करने और उनके साथ सहभागिता करने की क्षमता के साथ मह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को बुनियादी विज्ञान में उन्नत अध्ययन संस्थान की अनुसंधान परिषद (IASBS), ज़ंजन, ईरान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
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