היתוך גנים אונגניים באמצעות שרשרת מעוגנת התגובה השרשרת מעוגן ואחריו רצף הדור הבא
Summary
מאמר זה מפרט את השימוש ברשת מעוגנת מערכת התגובה המבוססת על תגובת שרשרת של הספרייה ואחריו ברצף הדור הבא כדי להעריך את fusions גן אונגניים בדגימות הגידול הקליני מוצק. מתוארים שלבי הספסל הרטוב וניתוח הנתונים.
Abstract
ג’ין fusions לעתים קרובות לתרום הפנוגניים הפנטיפ של סוגים רבים ושונים של סרטן. בנוסף, הנוכחות של fusions מסוימים בדגימות מחולי סרטן לעתים קרובות ישירות משפיע על אבחון, פרוגנוזה, ו/או טיפול בחירה. כתוצאה מכך, זיהוי מדויק של fusions גן הפך למרכיב קריטי של ניהול קליני עבור סוגי מחלות רבות. עד לאחרונה, זיהוי היתוך הגן הקליני הושג בעיקר באמצעות שימוש באחד הגנים assays. עם זאת, את הרשימה ההולכת וגוברת של גנים fusions עם משמעות קלינית יצרה צורך בהערכת סטטוס היתוך של גנים מרובים בו זמנית. רצף הדור הבא (NGS) מבוססי בדיקות פגש ביקוש זה דרך היכולת לרצף חומצת גרעין בצורה מקבילה בנפט. מספר גישות מבוססות NGS המעסיקים אסטרטגיות שונות עבור העשרה היעד גנטי זמינים כעת לשימוש באבחון מולקולרי קליני, כל אחד עם החוזקות שלה חולשות. מאמר זה מתאר את השימוש במגה-בתים מעוגנים PCR (AMP) מבוסס העשרה יעד הכנה הספריה ואחריו NGS כדי להעריך את הגן fusions בדגימות הגידול הקליני מוצק. AMP היא ייחודית בקרב גישות העשרה מבוססות amplicon כי הוא מזהה גנים fusions ללא קשר לזהותו של שותף הפיוז. מפורטים כאן הן הספסל רטוב וניתוח נתונים שלבים שמבטיחים זיהוי היתוך גנטי מדויק מדגימות קליניות.
Introduction
המיזוג של שניים או יותר גנים לתוך ישות בודדת הטרנססקריפט יכול להתרחש כתוצאה של וריאציות בקנה מידה גדול כרומוזום כולל מחיקות, כפילויות, הוספות, inversions, ו translocations. באמצעות שינוי שליטה ההמרה ו/או מאפיינים פונקציונליים משתנה של המוצר הגן המבוטא, אלה גנים היתוך יכול להעניק מאפיינים אונגניים לתאים סרטניים1. במקרים רבים, גנים היתוך ידועים לשמש מנהלי אונגניים העיקרי על ידי הפעלת התפשטות הסלולר ומסלולים הישרדות.
הרלוונטיות הקלינית של fusions גנים לחולי סרטן התברר תחילה עם גילוי של כרומוזום פילדלפיה ואת הגן המקביל Bcr-ABL1 fusion ב לוקמיה myeloסוגני כרונית (cml)2. מולקולה קטנה מעכב imatinib mesylate פותחה במיוחד היעד הזה גן היתוך והפגינו יעילות יוצאת דופן Bcr-ABL1-חיובי cml חולים3. התמקדות טיפולית של fusions גן אונגניים יש גם הצליח בגידולים מוצקים, עם עיכוב של הROS1 והפיוז גנים בסרטן שאינם קטנים הריאות התאים לשמש דוגמאות ראשיות4,5. לאחרונה, מעכב NTRK המעכב את ה-FDA אושרה עבור NTRK1/2/3 פיוז’ן-חיובי מוצק גידולים, ללא קשר לאתר מחלה6. מעבר בחירת תרפיה, זיהוי היתוך גנטי יש גם תפקידים אבחון המחלה פרוגנוזה. זה נפוץ במיוחד סרקומה שונים וסוגי ממאירות המטולוגיים המוגדרים באופן מאבחן על ידי נוכחות של fusions ספציפי ו/או עבור איזו נוכחות של היתוך ישירות מודיע פרוגנוזה7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. אלה הם אבל כמה דוגמאות של היישום הקליני של זיהוי היתוך גנטי לחולי סרטן.
בשל התפקיד הקריטי בקבלת החלטות קליניות, זיהוי היתוך גנטי מדויק מדגימות קליניות הוא בעל חשיבות חיונית. טכניקות רבות הוחלו במעבדות הקליני לניתוח היתוך או כרומוזומיום כולל: שיטות ציטוגנטיות, הפוכה הפוך תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR), זריחה בתוך היברידיזציה באתרו (דג), אימונוהיסטוכימיה (ihc), וביטוי של 5 ‘/3 ‘ ניתוח חוסר איזון (בין היתר)12,13,14,15. כיום, הרשימה המתרחב במהירות של גן שימושי fusions בסרטן הביא את הצורך להעריך סטטוס היתוך של גנים מרובים בו זמנית. כתוצאה מכך, כמה טכניקות מסורתיות שיכולות רק לבצע שאילתה אחת או כמה גנים בזמן הם הופכים גישות לא יעילות, במיוחד כאשר בהתחשב כי דגימות הגידול הקליני הם לעתים קרובות מאוד סופי ולא מוכן להיות מחולק בין כמה assays מספר. רצף הדור הבא (ngs), עם זאת, היא פלטפורמת ניתוח כי הוא מתאים גם עבור בדיקות מרובות גנים, ו ngs מבוסס בחני הפכו נפוצים במעבדות אבחון קליני מולקולרי.
משמש כיום ngs בחני לאיתור היתוך/סידור מחדש לגבי חומר הקלט המשמש, את ה המועסקים להכנת הספריה העשרה היעד, ואת מספר הגנים שאילתות בתוך הסדר. Ngs בחני יכול להיות מבוסס על RNA או DNA (או שניהם) שחולצו מן המדגם. למרות RNA מבוססי ניתוח הוא הקשה על ידי הנטייה של דגימות קליניות להכיל RNA מושפל מאוד, זה חוסם את הצורך רצף introns גדולים לעתים קרובות חוזרות כי הם מטרות של בדיקות היתוך מבוססי DNA אבל הוכיחו להיות קשה NGS . ניתוח נתונים16 אסטרטגיות העשרה יעד עבור מבוססי RNA ngs בחני יכול להיות מחולק במידה רבה ללכידה היברידית או amplicon-בתיווך גישות. בעוד ששתי האסטרטגיות שנוצלו בהצלחה לאיתור היתוך, כל אחד מהם מכיל יתרונות על פני17,18. היברידית לכידת בחני התוצאה בדרך כלל בספריות מורכבות יותר מופחתת allelic נושרת, בעוד amplicon מבוסס בחני בדרך כלל דורשים קלט נמוך ותוצאה פחות מחוץ למטרה רצף19. עם זאת, אולי המגבלה העיקרית של העשרה המסורתית מבוסס amplicon הוא הצורך בצבעי היסוד לכל שותפי היתוך ידועים. זה בעייתי מאז רבים הגנים החשובים קלינית ידועים הפתיל עם עשרות שותפים שונים, וגם אם העיצוב התחל מותר לגילוי של כל השותפים הידועים, הרומן היתוך אירועים יישאר לא מזוהה. טכניקה שתוארה לאחרונה כינה מספר מעוגן PCR (או AMP עבור קצר) כתובות זה מגבלה20. ב AMP, מתאם ‘ חצי פונקציונלי ‘ NGS הוא ליגלים לרסיסים cDNA הנגזרים מ-RNA קלט. העשרה היעד מושגת על ידי הגברה בין התחל הספציפי גנים התחל למתאם. כתוצאה מכך, כל הfusions לגנים של עניין, גם אם שותף היתוך הרומן מעורב, יש לזהות (ראה איור 1). מאמר זה מתאר את השימוש בערכת הגידול המלא של ArcherDx, מבוסס NGS, אשר מעסיקה AMP עבור העשרה היעד והכנת הספריה, לאיתור fusions גן אונגניים בדגימות הגידול מוצק (ראה טבלה משלימים 1 עבור רשימת גנים מלאה). פרוטוקול הספסל רטוב וניתוח נתונים הצעדים אומתו בקפדנות בתיקונים קליניים שיפור במעבדה (CLIA) מעבדה מוסמכת.
Protocol
Representative Results
Discussion
העשרה היעד המבוסס על PCR והכנה הספריה מעוגנת ואחריו רצף הדור הבא מתאים גם להערכת היתוך גנים מולטיקות בדגימות הגידול הקליני. על ידי התמקדות בקלט RNA במקום DNA גנומית, הצורך ברצף introns גדולים וחוזרים הוא נמנע. בנוסף, מאז גישה זו מגבירה את הגן fusions ללא קשר לזהותו של שותף היתוך, fusions הרומן מזוהים. זהו י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי משאב משותף לפתולוגיה מולקולרית של אוניברסיטת קולורדו (המכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכה מענקים לא. P30-CA046934) ועל ידי מרכז קולורדו לרפואה אישית.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
