Онкогенный ген Fusion Обнаружение Использование якорный мультиплекс полимеразы Цепная реакция после следующего поколения секвенирования
Summary
В этой статье подробно использование якорь мультиплекс полимеразы цепи реакции на основе библиотеки подготовки комплекта следуют следующего поколения секвенирования для оценки онкогенных синтезов генов в клинических твердых образцов опухоли. Описаны как шаги по анализу влажной скамейки, так и для анализа данных.
Abstract
Слияния генов часто способствуют онкогенному фенотипу многих различных видов рака. Кроме того, наличие определенных сплавов в образцах больных раком часто непосредственно влияет на диагностику, прогноз и/или выбор терапии. В результате, точное обнаружение слияний генов стало важнейшим компонентом клинического управления для многих типов заболеваний. До недавнего времени клиническое обнаружение синтеза генов осуществлялось преимущественно за счет использования одногенных анализов. Однако постоянно растущий список генных слияний с клиническим значением создал необходимость одновременной оценки состояния синтеза нескольких генов. Следующее поколение секвенирования (NGS) на основе тестирования удовлетворяет этот спрос за счет способности последовательности нуклеиновой кислоты в массово параллельной моды. Несколько NGS-подходов, использующих различные стратегии для обогащения генов, теперь доступны для использования в клинической молекулярной диагностике, каждый из которых имеет свои сильные и слабые стороны. В этой статье описывается использование якорного мультиплекса ПЦР (AMP) на основе целевого обогащения и подготовки библиотеки следуют NGS для оценки синтеза генов в клинических твердых образцов опухоли. AMP является уникальным среди ампрона основе обогащения подходов в том, что он определяет слияния генов, независимо от личности партнера слияния. Подробно здесь представлены как шаги по анализу влажной скамейки, так и для анализа данных, которые обеспечивают точное обнаружение синтеза генов из клинических образцов.
Introduction
Слияние двух или более генов в одну транскрипционную сущность может произойти в результате крупномасштабных хромосомных вариаций, включая удаления, дублирование, вставки, инверсии и транслокации. Благодаря измененному транскрипционному контролю и/или измененным функциональным свойствам выраженного генногопродукта эти гены синтеза могут придать онкологическим свойствам раковые клетки 1. Во многих случаях, синтез генов, как известно, выступать в качестве основных онкогенных драйверов путем непосредственной активации клеточной пролиферации и путей выживания.
Клиническая актуальность синтезов генов для онкологических больных впервые стала очевидной с открытием филадельфийской хромосомы и соответствующего гена синтеза BCR-ABL1 при хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ)2. Небольшой ингибитор молекулы imatinib мезилат был разработан специально для целевой этот ген синтеза и продемонстрировали замечательную эффективность в BCR-ABL1-положительныхпациентов CML3. Терапевтическая таргетинг онкогенных синтезов генов также был успешным в твердых опухолей, с ингибированием ALK и ROS1 синтеза генов в немелкоклеточного рака легких, выступающей в качестве основных примеров4,5. Недавно ингибитор NTRK larotrectinib был одобрен FDA для NTRK1/2/3 синтеза положительных твердых опухолей, независимо от болезни сайта6. Помимо выбора терапии, обнаружение синтеза генов также играет роль в диагностике и прогнозе заболевания. Это особенно распространено в различных саркома и гематологические злокачественные подтипы, которые диагностически определяется наличием конкретных слияний и / или для которых наличие синтеза непосредственно информирует прогноз7,8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11. Это лишь некоторые из примеров клинического применения обнаружения синтеза генов для онкологических больных.
Из-за важной роли в принятии клинических решений, точное обнаружение синтеза генов из клинических образцов имеет жизненно важное значение. Многочисленные методы были применены в клинических лабораториях для синтеза или хромосомных анализ овранговых реаний, включая: цитогенетические методы, обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (RT-PCR), флуоресценция на месте гибридизации (FISH), иммуногистохимии (IHC), и 5’/3’анализ дисбаланса выражения (среди прочих)12,13,14,15. В настоящее время быстро расширяющийся список действенных слияний генов при раке привел к необходимости одновременного оценки состояния синтеза нескольких генов. Следовательно, некоторые традиционные методы, которые могут задать запрос только один или несколько генов в то время, становятся неэффективными подходами, особенно если учесть, что клинические образцы опухоли часто очень конечны и не поддаются быть разделены между несколькими анализами. Последовательное ирование нового поколения (NGS), однако, является аналитической платформой, которая хорошо подходит для тестирования нескольких генов, и NGS-анализы стали распространены в клинических молекулярно-диагностических лабораториях.
В настоящее время используемые NGS анализы для слияния / перестановки обнаружения варьируются в отношении входной материал используется, химии, используемые для подготовки библиотеки и целевого обогащения, и количество генов, запрошенных в рамках расследования. NGS анализы могут быть основаны на РНК или ДНК (или оба) извлечены из образца. Хотя анализ на основе РНК препятствует тенденция клинических образцов содержать сильно деградировали РНК, он обходит необходимость последовательности больших и часто повторяющихся интронов, которые являются целями ДНК-тестирования синтеза, но оказались трудными для NGS анализ данных16. Стратегии целевого обогащения для анализов NGS на основе РНК можно в значительной степени разделить на гибридные подходы захвата или ампромнонов. Хотя обе стратегии были успешно использованы для обнаружения синтеза, каждая из них содержит преимущества по сравнению с другими17,18. Гибридные анализы захвата обычно приводят к более сложным библиотекам и уменьшенному аллелинческому отсеву, в то время как анализы на основе ампииконов обычно требуют более низкого ввода и приводят к меньшему секвенированию19. Однако, возможно, основным ограничением традиционного обогащения на основе ампииконов является потребность в грунтовки для всех известных партнеров по слиянию. Это проблематично, так как многие клинически важные гены, как известно, сливается с десятками различных партнеров, и даже если грунтовка дизайн позволил для обнаружения всех известных партнеров, новые события синтеза останется незамеченным. Недавно описанный метод называется якорь мультиплекс PCR (или AMP для краткости) адреса этого ограничения20. В AMP ,полуфункциональный” адаптер NGS привязываются к фрагментам кДНК, полученным из входной РНК. Целевое обогащение достигается за счет усиления между генными грунтовками и грунтовкой для адаптера. В результате, все слияния с генами, представляющими интерес, даже если речь идет о новом партнере по слиянию, должны быть обнаружены (см. рисунок1). В этой статье описывается использование комплекта АрчерDx FusionPlex Solid Tumor, ngS-аналитического комитета, который использует AMP для целевого обогащения и подготовки библиотеки, для обнаружения онкогенных синтезов генов в твердых образцах опухолей (см. Дополнительную таблицу 1 для полный список генов). Протокол с мокрой скамейкой и шаги по анализу данных были тщательно проверены в сертифицированной лаборатории по улучшению клинической лаборатории (CLIA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Якорный мультиплекс ПЦР основе целевого обогащения и подготовки библиотеки следуют следующего поколения секвенирования хорошо подходит для мультиплексной оценки синтеза генов в клинических образцов опухоли. Сосредоточившись на входе РНК, а не на геномной ДНК, избегается необходимо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана молекулярной патологии Общий ресурс Университета Колорадо (Национальный институт рака центр поддержки Грант No. P30-CA046934) и Колорадо Центр персонализированной медицины.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
