Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e tessuti cerebrali, utilizzando immunofluorescenza colorazione e metodi di DNA dot-blot.
Abstract
Sono state identificate diverse modifiche del DNA nel genoma dei mammiferi. Di questi, sono stati studiati intensamente i meccanismi epigenetici mediati da 5-metilcytosina e 5-idrossimethylcytosine. 5-idrossimetilcitosina mostra caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo embrionale e postnatale del cervello, svolge una funzione regolatrice nell’espressione genica, ed è coinvolto in più disturbi neurologici. Qui, descriviamo i metodi dettagliati tra cui l’immunofluorescenza colorazione e DNA dot-blot per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule coltivate e tessuti cerebrali del topo.
Introduction
Le modifiche epigenetiche, tra cui la modificazione del DNA, la modificazione dell’istone e la modificazione dell’RNA, hanno dimostrato di svolgere funzioni essenziali in diversi processi biologici e malattie1,2,3, 4 DEL psu’ , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Per lungo tempo, la metilazione del DNA (cioè la metilcitosina 5 mC) è stata vista come un marcatore epigenetico altamente stabile e non può essere ulteriormente modificata nel genoma. Recentemente, è stato scoperto che 5-mC potrebbe essere ossidato a 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) da TET (Dieci-undici traslocazioni) proteine di famiglia tra cui TET1, TET2, e TET38,9. Ulteriori studi dimostrano che 5-hmC potrebbe fungere da marcatore stabile e svolgere ruoli biologici attraverso la regolazione dell’espressione genica4,10,11,12.
Le prove attuali indicano che 5-hmC è altamente arricchito nei tessuti neuronali / cellule rispetto ad altri tipi di tessuti nei mammiferi, e presenta caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo neuronale13,14. Nel sistema neuronale, le modifiche epigenetiche mediate a 5-hmC svolgono un ruolo importante nella regolazione delle cellule staminali neurali, dell’attività neuronale, dell’apprendimento e della memoria, ed è coinvolta in molteplici disturbi neurologici tra cui la sindrome di Rett, l’autismo, l’Alzheimer malattia di Huntington, ecc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Ci sono diversi approcci per rilevare 5-hmC in cellule e tessuti14,21,22,23,24. Qui, descriviamo due metodi per rilevare l’esistenza di 5-hmC e quantificare il livello globale di 5-hmC: colorazione immunofluorescenza e DNA dot-blot. Questi due metodi sono convenienti e sensibili, e sono stati utilizzati con successo negli studi precedenti25,26,27,28,29,30. I passaggi chiave di questi due metodi sono la denaturazione del DNA. Per la colorazione immunofluorescenza di 5-hmC, è necessario pre-trattamento di campioni con 1 M HCl. Per una macchia di punti da 5-hmC, la denaturazione del DNA viene eseguita con soluzione NaOH. Questi due metodi insieme al sequenziamento di nuova generazione sono strumenti molto utili per studiare la funzione di 5-hmC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modifiche epigenetiche svolgono un ruolo essenziale durante lo sviluppo cerebrale, la maturazione e la funzione. Come marcatore stabile per la modifica del DNA, dinamico 5-hmC risponde all’adattamento comportamentale, all’attività neuronale, ed è positivamente correlato con l’espressione genica; così, è coinvolto nella normale funzione del cervello e disturbo neurologico4. Per esplorare la sua funzione nelle cellule e nei tessuti, è necessario rilevare l’esistenza di 5-hmC e confrontare il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XL è stata sostenuta in parte dal National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) e dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518). Q.S. è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) e dal Key Research and Development Program della provincia di ehejiang (2017C03009). W.X. è stato sostenuto dalla Fondazione di Scienze Naturali della provincia di ejiang (LY18H020002) e dal Dipartimento di Tecnologia Della Scienza della provincia di Ehejiang (2017C37057).
Materials
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
| epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
| forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
| neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
| nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
| OCT | Leica | 14020108926 |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
| phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
| proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
| retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
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