Summary

Обнаружение 5-гидроксиметилцитозин в нейронных стволовых клетках и мозгах мышей

Published: September 19, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в клетках и тканях мозга, используя иммунофлуоресцентное окрашивание и методы точечной пятна ДНК.

Abstract

В геноме млекопитающих были выявлены множественные модификации ДНК. Из них интенсивно изучены 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин-опосредованные эпигенетические механизмы. 5-гидроксиметилцитозин отображает динамические особенности во время эмбрионального и послеродового развития мозга, играет регулятивную функцию в экспрессии генов и участвует в множественных неврологических расстройствах. Здесь мы описываем подробные методы, включая иммунофлуоресцентное окрашивание и днк-пятна для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в культивированных клетках и тканях мозга мыши.

Introduction

Эпигенетические модификации, включая модификацию ДНК, модификацию гистона и модификацию РНК, как было показано, играют важную роль в различных биологических процессах и заболеваниях1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Долгое время метилирование ДНК (т.е. 5-метилцитозина (5-мС)) рассматривалось как высокостабильный эпигенетический маркер и не может быть дополнительно изменено в геноме. Недавно было установлено, что 5-mC может быть окислен до 5-гидроксиметилцитозина (5-хмС) TET (Десять-одиннадцать транслокаций) семейных белков, включая TET1, TET2, и TET38,9. Дальнейшие исследования показывают, что 5-hmC может служить стабильным маркером и играть биологические роли путем регулирования экспрессии генов4,10,11,12.

Настоящие данные свидетельствуют о том, что 5-хмС высоко обогащен нейронными тканями/клетками по сравнению с другими типами тканей у млекопитающих, и обладает динамическими особенностями во время развития нейронов13,14. В нейрональной системе, 5-hmC опосредованные эпигенетические модификации играют важную роль в регулировании нервных стволовых клеток, нейронной активности, обучения и памяти, и участвует в нескольких неврологических расстройств, включая синдром Ретт, аутизм, болезнь Альцгеймера болезни, болезнь Гентингтона и др.2,13,15,16,17,18,19,20.

Существует несколько подходов к обнаружению 5-хмВ в клетках и тканях14,21,22,23,24. Здесь мы описываем два метода обнаружения существования 5-хмИ и количественной оценки глобального уровня 5-хмС: иммунофлуоресцентное окрашивание и точечная поместья ДНК. Эти два метода удобны и чувствительны, и были успешно использованы в предыдущих исследованиях25,26,27,28,29,30. Ключевыми шагами этих двух методов являются денатурация ДНК. Для окрашивания иммунофлюоресценции 5-хмС требуется предварительная обработка образцов с 1 М ЛК. Для 5-хмC точечной блохины, денатурация ДНК выполняется с раствором NaOH. Эти два метода вместе с секвенированием следующего поколения являются очень полезными инструментами для исследования функции 5-hmC.

Protocol

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Чжэцзян. 1. Культура взрослых нейронных стволовых клеток и нейронов Изолировать взрослых нейронных стволовых клеток из передний мозг взрослого (8-10 недель) C57/BL6 мужской мыши, как описа…

Representative Results

Чтобы выявить распределение 5-хмВ в гиппокампе взрослых мышей, мы выполнили иммунофлуоресценцию с антителами против нейрональных клеток (NeuN) и 5-hmC. В гиппокампе, 5-hmC совместно локализованы хорошо с нейрональной клеточной маркерной нейН(Рисунок 1A-H), предлагая об?…

Discussion

Эпигенетические модификации играют важную роль при развитии мозга, созревании и функции. Как стабильный маркер для модификации ДНК, динамический 5-hmC реагирует на поведенческую адаптацию, нейронную активность, и положительно коррелирует с экспрессией генов; Таким образом, он участвует…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

XL была частично поддержана Национальной программой исследований и разбивки ключей Китая (2017YFE0196600) и Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No s. 31771395, 31571518). З.С. была поддержана Национальной программой исследований и развития ключевых стран Китая (2017YFC1001703) и Ключевой программой исследований и разработок провинции Чжэцзян (2017C03009). W.X. была поддержана Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LY18H020002) и Отделом науки провинции Чжэцзян (2017C37057).

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
neurobasal medium Gibco 21103-049
normal goat serum Vector Laboratories Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
proteinase K VVR 39450-01-6
retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

References

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer’s disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer’s disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Play Video

Cite This Article
Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).

View Video