Påvisning av 5-Hydroxymethylcytosine i nevrale stamceller og hjerner av mus

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å oppdage 5-hydroxymethylcytosine i celler og hjernen vev, utnytte immunofluorescence farging og DNA dot-blot metoder.

Abstract

Flere DNA modifikasjoner har blitt identifisert i pattedyr Genova. Av det, 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine-mediert epigenetic mekanismer har vært intensivt studert. 5-hydroxymethylcytosine viser dynamiske funksjoner under embryonale og postnatal utviklingen av hjernen, spiller en regulerende funksjon i genuttrykk, og er involvert i flere nevrologiske lidelser. Her beskriver vi detaljerte metoder inkludert immunofluorescence farging og DNA dot-blot å oppdage 5-hydroxymethylcytosine i kulturperler celler og hjernen vev av mus.

Introduction

Epigenetic modifikasjoner, inkludert DNA modifikasjon, histone modifisering og RNA modifisering, har vist å spille viktige funksjoner i ulike biologiske prosesser og sykdommer^{1,2,3, 4} andre priser ^{, 5} andre priser ^{, 6} andre priser ^{, 7}. i lang tid, DNA metylering (dvs. 5-methylcytosine (5-mC)) har blitt sett på som en svært stabil epigenetic markør og kan ikke bli ytterligere endret i Genova. Nylig har det blitt funnet at 5-mC kan være oksidert til 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) av tet (Ten-eleven translokasjoner) familie proteiner inkludert TET1, TET2, og TET3^8,9. Videre studier viser at 5-hmC kan tjene som en stabil markør og spille biologiske roller gjennom å regulere genuttrykk^4,10,11,12.

Den nåværende bevisene tyder på at 5-hmC er svært beriket i neuronal vev/celler i forhold til andre typer vev i pattedyr, og utstillinger dynamiske funksjoner under neuronal utvikling^13,14. I neuronal systemet, 5-hmC mediert epigenetic modifikasjoner spiller en viktig rolle i å regulere nevrale stamceller, neuronal aktivitet, læring og hukommelse, og er involvert i flere nevrologiske lidelser, inkludert rett syndrom, autisme, Alzheimers sykdom, Huntington sykdom, etc.^{2,13,15,16,17,18,19,20}.

Det er flere tilnærminger for å oppdage 5-hmC i celler og vev^{14,21,22,23,24}. Her beskriver vi to metoder for å oppdage eksistensen av 5-hmC og Kvantifisere det globale nivået av 5-hmC: immunofluorescence farging og DNA dot-blot. Disse to metodene er praktiske og følsomme, og har blitt brukt i tidligere studier^{25,26,27,28,29,30}. De viktigste trinnene i disse to metodene er DNA-denaturering. For immunofluorescence farging av 5-hmC er forhåndsbehandling av prøver med 1 M HCl nødvendig. For 5-hmC dot-blot utføres DNA-denaturering med NaOH-løsning. Disse to metodene sammen med neste generasjons sekvensering er svært nyttig verktøy for å undersøke funksjonen til 5-hmC.

Protocol

Alle dyr prosedyrene er godkjent av Animal etikk Committee of Zhejiang University. 1. kulturen i voksen nevrale stamceller og neurons Isolere voksen nevrale stamceller fra forebrain av en voksen (8-10 uke gammel) C57/BL6 mannlig mus som beskrevet tidligere31,32. Kultur voksen nevrale stamceller i DMEM/F-12 medium som inneholder 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 supplement, 1% antibiotika-antimykotisk, og 2 mM L-g…

Representative Results

For å avdekke fordelingen av 5-hmC i hippocampus hos voksne mus, utførte vi immunofluorescence med antistoffer mot neuronal celler (NeuN) og 5-hmC. I hippocampus, 5-hmC co-lokaliserte godt med neuronal celle markør NeuN (figur 1a-H), antyder en berikelse av 5-hmC i neurons. For å bestemme dynamikken i 5-hmC under neuronal utvikling, en dot-blot ble først utført med DNA-prøver isolert fra voksende og differensiert voksen nevrale stamceller (…

Discussion

Epigenetic modifikasjoner spiller viktige roller under hjernens utvikling, modning og funksjon. Som en stabil markør for DNA modifisering, dynamisk 5-hmC reagerer på atferdsmessige tilpasning, neuronal aktivitet, og er positivt korrelert med genuttrykk; Dermed er det involvert i normal funksjon av hjernen og nevrologisk lidelse⁴. For å utforske sin funksjon i celler og vev, er det nødvendig å oppdage eksistensen av 5-hmC og sammenligne nivået før og etter behandling. Her demonstrerte vi to …

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
neurobasal medium	Gibco	21103-049
normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
proteinase K	VVR	39450-01-6
retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210