Anvendelse af frosset væv i Comet-analysen til vurdering af DNA-skader
Summary
Denne protokol beskriver flere procedurer for fremstilling af frosne vævsprøver af høj kvalitet på tidspunktet for obduktion til brug i kometanalysen til vurdering af DNA-skader: 1) hakket væv, 2) skrabede epitelceller fra mave-tarmkanalen og 3) ternet væv prøver, der kræver homogenisering ved hjælp af en vævshakkeanordning.
Abstract
Kometen assay er stigende popularitet som et middel til at vurdere DNA-skader i dyrkede celler og væv, især efter udsættelse for kemikalier eller andre miljømæssige stressfaktorer. Brugen af kometanalysen i reguleringstest for genotoksisk potentiale hos gnavere er blevet drevet af vedtagelsen af en testretningslinje for Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) i 2014. Comet assay dias er typisk fremstillet af frisk væv på tidspunktet for obduktion; frysning af vævsprøver kan dog undgå logistiske udfordringer i forbindelse med samtidig tilberedning af objektglas fra flere organer pr. dyr og fra mange dyr pr. undersøgelse. Frysning gør det også muligt at sende prøver fra eksponeringsanlægget til et andet laboratorium til analyse, og opbevaring af frosset væv gør det lettere at udskyde en beslutning om at generere DNA-skadesdata for et givet organ. Den alkaliske kometanalyse er nyttig til påvisning af eksponeringsrelaterede DNA-dobbelt- og enkeltstrengsbrud, alkaliske labilelæsioner og strandbrud forbundet med ufuldstændig DNA-excisionreparation. Men, DNA-skader kan også skyldes mekanisk klipning eller forkert prøve behandling procedurer, confounding resultaterne af analysen. Reproducerbarhed ved indsamling og behandling af vævsprøver under obduktioner kan være vanskelig at kontrollere på grund af svingende laboratoriepersonale med varierende erfaring med høst af væv til kometanalysen. Det er dyrt og er muligvis ikke altid muligt at forbedre sammenhængen gennem genopfriskningstræning eller implementering af mobile enheder, der er bemandet med erfarent laboratoriepersonale. For at optimere ensartet generation af prøver af høj kvalitet til kometanalyseanalyse blev en metode til homogenisering af frosne flashterninger af væv ved hjælp af en tilpasset vævshakkeanordning evalueret. Prøver forberedt til kometen analyse ved denne metode sammenlignes positivt i kvalitet til friske og frosne vævsprøver fremstillet ved hakke under obduktion. Desuden blev lav baseline DNA-skade målt i celler fra frosne terninger af væv efter langvarig opbevaring.
Introduction
Kometanalysen anvendes i stigende grad som et middel til at vurdere DNA-skader i dyrkede celler og væv, der udsættes for kemikalier eller andre miljøstressfaktorer1. Analysen kan detektere DNA dobbelt- og enkeltstrengsbrud, alkali-labile læsioner og enkeltstrengede brud forbundet med ufuldstændig DNA-reparation. Det Internationale Råd for Harmonisering af Tekniske Krav til Lægemidler til Human anvendelse (ICH) retningslinje for farmaceutiske test anbefaler en DNA-streng brud assay såsom komet en analyse som en anden test for at supplere gnaver erythrocyt micronucleus assay til vurdering af in vivo genotoksicitet og som en opfølgende test for vurdering af virkningsmekanisme i mål organer tumor induktion2. Den Europæiske Fødevaresikkerhedsautoritet (EFSA) anbefaler in vivo-kometanalysen som en passende opfølgningstest til undersøgelse af relevansen af et positivt resultat i en in vitro-genottoksicitetstest3. I 2014 blev der godkendt en OECD-testretningslinje for gnaverkometanalysen, hvilket øger accepten af analysen til brug ved myndighedstest af genotoksisk potentiale. Analysen er baseret på elektroforetisk adskillelse af afslappede DNA-sløjfer og fragmenter, der migrerer fra nucleoids af lysed celler. Dybest set, enkelte celler er indlejret i agarose, der er blevet lagdelt på mikroskop dias. Slides nedsænkes derefter i lysisbuffer efterfulgt af en alkalisk (pH > 13) opløsning, som gør det muligt for det tæt oprullede nukleare DNA at slappe af og slappe af. Slides placeres derefter i et elektrisk felt, som stimulerer migration af negativt ladet DNA mod anoden, hvilket skaber billeder, der ligner kometer; den relative mængde DNA i kometenen sammenlignet med komethovedet er direkte proportionalt med mængden af DNA-skader DNA-indhold i halen er typisk kvantificeret ved hjælp af digital billedbehandling software.
Da kometanalysen registrerer fragmenteret DNA, kan nøjagtig kvantificering af eksponeringsinduceret DNA-skade blive forvirret af chromatinfragmentering forbundet med nekrose eller apoptose som følge af behandlingsinduceret cytotoksicitet eller stress. Desuden kan DNA-skader opstå som følge af mekanisk klipning eller forkert prøvebehandling4. Betydningen af at opretholde høstet væv nedkølet før tilberedning af glide for at minimere baselineniveauet for DNA-skader er tidligere blevet påvist5,6. Mange laboratorier forberede komet analyse dias fra frisk væv; Dette kan dog være logistisk udfordrende, når der fremstilles objektglas fra flere vævstyper pr. dyr i en undersøgelse med et stort antal dyr. Desuden udgør dette et problem, når diasforberedelse og -analyse skal finde sted på et fjerntliggende laboratorium, hvilket nødvendiggør forsendelse af prøver. For eksempel omfatter US National Toxicology Program kometen assay som en del af sin genetiske toksikologi testprogram (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) og undertiden inkorporerer analysen i 28 eller 90 dages gentagen dosis toksicitet undersøgelser; dette kræver, at laboratoriet indsamles af væv, og at prøverne overføres til et andet laboratorium til analyse. For at opnå dette hakkes vævsstykker, og/eller epitelceller i mave-tarmkanalen skrabes, og cellesuspensioner nedfryses og opbevares i en fryser til efterfølgende forsendelse og opbevaring af det modtagende laboratorium indtil analyse7. Korrekt håndtering af prøver er afgørende for at opnå data af høj kvalitet ved hjælp af frosset væv. det er imidlertid vanskeligt at kontrollere reproducerbar manipulation af vævsprøver under obduktioner udført af personale i konstant forandring, især i laboratorier i live, som ikke rutinemæssigt høster væv til kometanalysen. Genopfriskningstræning af samlepersonale eller brug af en mobil enhed, der er bemandet med erfarent laboratoriepersonale til indsamling af friske eller frosne vævsprøver, er ofte for dyr, ikke mulig eller blot undervurderet.
For bedre at sikre ensartet generation af høj kvalitet vævsprøver til overførsel til et fjerntliggende sted for komet analyse, nytten af en offentliggjort metode6 af væv bevarelse fra flash frosne terninger af væv blev undersøgt. Ved denne metode lægges frosne terninger af væv ind i en papirhakkeanordning i rustfrit stål (figur 1), som anbringes i et mikrocentrifugerør, der indeholder kold buffer. Terningen af væv skubbes derefter gennem en lille maskemaske for enden af enheden. Gentagne gange at tvinge vævsuspensionen gennem maskesien i begge retninger flere gange resulterer i en relativt ensartet enkeltcellesuspension. Prøver fremstillet ved denne metode sammenlignes positivt i kvalitet til både friske og frosne vævsprøver tilberedt ved hakkekød. Som en ekstra fordel, i modsætning til hakkede prøver, kan væv terninger opbevares frosset i længere tid og stadig give høj kvalitet resultater i kometen assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som påvist tidligere7,12,13, korrekt håndteret flash frosset hakket væv giver gode resultater i kometen assay. Faktisk er baseline % hale DNA-værdier for frossen hakket rotte og muselever tilberedt i vores laboratorium typisk ≤6%, som anbefalet af OECD’s testretningslinje9 for friskhakkede rotteleverprøver. Gode resultater er opnået af flere laboratorier ved hjælp af en række forskellige vævsty…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne står i gæld til Lincoln Martin og Kelley Owens for ekspert teknisk bistand forberedelse og scoring komet dias og Dr. Carol Swartz for at udføre statistiske analyser. Forfatterne anerkender også de støttende bidrag fra medlemmer af den genetiske toksikologi, undersøgende toksikologi, og obduktion programmer på ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
