שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א
Summary
פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.
Abstract
הטיפול שביט הוא צובר פופולריות כאמצעי להערכת נזק DNA בתאים מתורבתים ורקמות, במיוחד בעקבות חשיפה כימיקלים או שלחצים סביבתיים אחרים. השימוש שיטת שביט בבדיקת הרגולציה של פוטנציאל גנומיק של מכרסמים כבר מונע על ידי אימוץ של ארגון לשיתוף פעולה כלכלי ופיתוח (ה-OECD) בדיקת מנחה ב 2014. שקופיות של שביט מכינים בדרך כלל מרקמה טרייה בזמן נקרופסי; עם זאת, דוגמאות לרקמות מקפיא יכולות להימנע מאתגרים לוגיסטיים הקשורים להכנה בו של שקופיות מאיברים מרובים לכל בעל חיים ומבעלי חיים רבים ללימוד. ההקפאה גם מאפשרת דגימות משלוח ממתקן החשיפה למעבדה שונה לניתוח, ואחסון של רקמה קפואה מאפשר מאוד החלטה ליצור נתונים נזק DNA עבור איבר נתון. שיטת השביט האלקליין היא שימושית לזיהוי חשיפה של דנ א כפול ומעברי-גדיל בודדים, נגעים אלקלי-לבנה, והפסקות שלמות הקשורות לתיקון כריתה DNA לא מלאה. עם זאת, נזק לדנ א יכול לנבוע גם מהטיה מכנית או הליכי עיבוד לדוגמה פסולים, הקמת תוצאות הטיפול. שינוי באוסף ועיבוד של דגימות רקמות במהלך נקרוזים עלול להיות קשה לשלוט בשל העובדים מעבדה ברמות שונות של ניסיון בקצירת רקמות עבור שביט השביט. שיפור עקביות באמצעות הדרכה מרענן או הפריסה של יחידות ניידות מאויש עם אנשי מעבדה מנוסים הוא יקר ולא תמיד יכול להיות אפשרי. כדי לייעל את הדור העקבי של דגימות באיכות גבוהה עבור ניתוח שביט כוכב, שיטה עבור הומוגניזציה קוביות פלאש קפוא של רקמות באמצעות מכשיר מותאם אישית רקמת העור הוערך. דגימות שהוכנו לצורך שביט בשיטת השביט על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדוגמיות של רקמות טריות וקפואות שהוכנו על-ידי מינויה במהלך נקרופסי. יתר על כן, נזק DNA בסיסית נמוכה נמדד בתאים מקוביות קפואות של רקמות לאחר אחסון ממושך.
Introduction
שיטת השביט משמשת יותר ויותר כאמצעי להערכת נזקי DNA בתאים מתורבתים ורקמות חשופים לכימיקלים או לחצים סביבתיים אחרים1. האפשרות הניתנת לזיהוי הפסקות דנ א כפולות ויחיד, נגעים אלקלי-לבנה, ומעברי-גדיל בודדים הקשורים לתיקון DNA לא שלם. המועצה הבינלאומית להרמוניה של דרישות טכניות עבור תרופות לשימוש האדם (העליונה) מנחה עבור בדיקות התרופות ממליץ על הצירוף DNA שבירה כגון שיטת השביט כמבחן השני כדי להשלים את הטיפול מכרסם מיקרוקליאוס מיקרו להערכת vivo גנורעילות וכמבחן מעקב להערכת מצב של פעולה באברי היעדשל אינדוקציה גידול הרשות האירופית לבטיחות מזון (EFSA) ממליצה על שיטת שביט vivo כמבחן המשך המעקב המתאים לחקירת הרלוונטיות של תוצאה חיובית במבחן הרעילות של מבחנה3. ב-2014 אושרה מבחן ה-OECD לצורך הבחינה של כוכב השביט המכרסמים, ובכך הגבירה את יכולת ההתמדה לשימוש בבדיקות רגולטוריות של פוטנציאל הגנוטוקסיס. המנה מבוססת על הפרדה אלקטרופיניטית של לולאות DNA רגוע ושברי העוברים מתוך נוקלאונואידים של תאים ליטיים. ביסודו של דבר, תאים בודדים מוטבעים agarose כי כבר שכבתית על שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות לאחר מכן שקוע במאגר הליזה ואחריו בסיסי (pH > 13) פתרון, אשר מאפשר את ה-DNA הגרעינית היטב מתפתל להירגע ולהירגע. שקופיות ממוקמות לאחר מכן בשדה חשמלי, אשר מעורר הגירה של דנ א טעונה שלילית לקראת האנדה, יצירת תמונות הדומות לשביט; הכמות היחסית של ה-DNA בזנב השביט בהשוואה לראש כוכב השביט הוא פרופורציונלי באופן ישיר כמות של נזק DNA; תוכן ה-DNA בזנב הוא בדרך כלל בכמת באמצעות תוכנת דימות דיגיטלי.
בגלל שיטת השביט מזהה דנ א מפוצל, כימות מדויק של הנזק לחשיפה DNA המושרה יכול להיות מבולבל על ידי פיצול כרומטין הקשורים נמק או אפופטוזיס הנובע הטיפול המושרה ציטוזה או מתח. יתר על כן, נזק DNA יכול להתרחש כתוצאה של הטיה מכני או עיבוד לדוגמה לא תקין4. החשיבות של שמירה על רקמות שנקטפו מקורר לפני הכנת שקופית כדי למזער את רמת בסיסית של נזק DNA הפגינו בעבר5,6. מעבדות רבות מכינות שביט מתוך רקמה טרייה; עם זאת, הדבר יכול להיות מאתגר לוגיאני כאשר מכינים שקופיות מסוגי רקמות מרובים לכל בעל חיים במחקר עם מספר רב של בעלי חיים. כמו-כן, מדובר בבעיה כאשר ההכנה והניתוח של השקופיות מתרחשות במעבדה מרוחקת, הדורשת משלוח של דגימות. לדוגמה, תוכנית הטוקסיקולוגיה הלאומית של ארצות הברית כוללת את שיטת השביט כרכיב של תוכנית הרעלים הגנטית שלה בדיקה (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ולפעמים משלבת את הערך לתוך 28 או 90 יום לימודי הרעילות במינון; זה מחייבת אוסף של רקמות על ידי המעבדה בחיים והעברת דגימות למעבדה אחרת לניתוח. כדי להשיג את זה, חתיכות רקמה הם כתוש, ו/או תאים אפיתל של מערכת העיכול הם מגורד ושתלים סלולריים הם פלאש קפואים ומאוחסנים במקפיא עבור המשלוח הבאים ואחסון על ידי המעבדה המקבלת עד ניתוח7. טיפול נאות של דגימות חיוני להשגת נתונים באיכות גבוהה באמצעות רקמה קפואה; עם זאת, מניפולציה בלתי משתנה של דגימות רקמה במהלך נקרוזים שבוצעו על ידי אנשים שמשתנים אי פעם קשה לשלוט, במיוחד במעבדות בחיים כי לא באופן שגרתי הקציר רקמות עבור שביט השביט. רענון האימון של צוות נמק או שימוש ביחידה ניידת מאויש על ידי אנשי מעבדה מנוסים כדי לאסוף דגימות רקמות טריות או קפואות הוא לעתים קרובות יקר מדי, לא ריאלי, או פשוט חסר ערך.
כדי להבטיח בצורה טובה יותר את הדור העקבי של דגימות רקמה באיכות גבוהה עבור העברה לאתר מרוחק עבור ניתוח שביט כוכב, השירות של שיטה שפורסמה6 של שימור רקמות מפני קוביות פלאש קפוא של רקמות נחקרו. בשיטה זו, קוביות קפוא של רקמות נטענים לתוך מכשיר מיקרו של רקמת נירוסטה (איור 1) הממוקם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מאגר קר. הקוביה של רקמות הוא דחף לאחר מכן דרך מד קטן שינוי בסוף המכשיר. שוב ושוב השעיית רקמות דרך מסננת שינוי בשני הכיוונים מספר פעמים גורמת השעיית תא אחיד בודד יחסית. דגימות שהוכנו על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדגימות רקמות טריות וקפואות שהוכנו על ידי מינויה. כתוספת תועלת, בניגוד דגימות בשר טחון, קוביות רקמה ניתן לאחסן קפוא לפרקי זמן ממושך ועדיין להניב תוצאות באיכות גבוהה בתוך שביט השביט.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שמתואר בעבר7,12,13, מטופלים כראוי פלאש קפוא ברקמות בשר טחון מספק תוצאות טובות שיטת שביט. למעשה, בסיסית% הזנב ערכי ה-DNA עבור עכברוש קצוץ וכבד העכבר המוכן במעבדה שלנו הם בדרך כלל ≤ 6%, כפי שמומלץ על-ידי מבחן ה-OECD מנחה9 עבור טרי דגי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה ללינקולן מרטין וקלי אוונס לסיוע טכני מומחה בהכנת שקופיות שביט והבקיע ד ר קרול שוורץ לביצוע ניתוחים סטטיסטיים. המחברים מכירים גם את התרומות התומכות של חברי הטוקסיקולוגיה הגנטית, החקירתית ותוכניות הנקרופסי ב-ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
