DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용
Summary
이 프로토콜은 DNA 손상을 평가하기 위해 혜성 분석실험에 사용하기 위해 부검 시 고품질 냉동 조직 샘플을 준비하기 위한 몇 가지 절차를 설명합니다: 1) 다진 조직, 2) 위장관에서 긁힌 상피 세포, 3) 큐브 조직 조직 다진 장치를 사용하여 균질화를 요구하는 샘플.
Abstract
혜성 분석은 배양 된 세포와 조직에서 DNA 손상을 평가하는 수단으로 인기를 얻고 있으며, 특히 화학 물질이나 다른 환경 스트레스 에 노출 된 후. 설치류에서 genotoxic 잠재력에 대한 규제 테스트에서 혜성 분석의 사용은 2014 년 경제 협력 및 개발 기구 (OECD) 테스트 가이드 라인의 채택에 의해 구동되었다. 혜성 분석 슬라이드는 전형적으로 부검시에 신선한 조직에서 제조된다; 그러나, 동결 조직 견본은 동물 당 그리고 연구 당 많은 동물에서 다중 기관에서 슬라이드의 동시 준비와 관련되었던 물류 도전을 피할 수 있습니다. 동결은 또한 분석을 위해 다른 실험실에 노출 시설에서 샘플을 선적 할 수 있으며, 냉동 조직의 저장은 주어진 기관에 대한 DNA 손상 데이터를 생성하는 결정을 연기 용이하게. 알칼리성 혜성 분석은 불완전한 DNA 절제 수선과 관련되었던 노출 관련 DNA 이중 및 단 하나 물가 나누기, 알칼리-labile 병변 및 가닥 나누기를 검출하기 위해 유용합니다. 그러나 DNA 손상은 또한 기계적 전단 또는 부적절한 샘플 처리 절차로 인해 분석 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 부검 중 조직 샘플의 수집 및 처리의 재현성은 혜성 분석에 대한 조직 을 수확하는 경험이 다양한 수준의 실험실 직원변동으로 인해 제어하기 어려울 수 있습니다. 숙련된 실험실 인력으로 구성된 모바일 장치의 재교육 또는 배포를 통해 일관성을 향상시키는 것은 비용이 많이 들며 항상 실현 가능하지는 않을 수 있습니다. 혜성 분석 분석을 위한 고품질 샘플의 일관된 생성을 최적화하기 위해 맞춤형 조직 채굴 장치를 사용하여 조직의 플래시 냉동 큐브를 균질화하는 방법을 평가하였다. 이 방법에 의해 혜성 분석에 대해 제조된 샘플은 부검 시 다진 에 의해 제조된 신선 및 냉동 조직 샘플에 대한 품질면에서 유리하게 비교하였다. 더욱이, 낮은 기준선 DNA 손상은 장기간 저장다음 조직의 동결 된 큐브에서 세포에서 측정되었다.
Introduction
혜성 분석기는 화학 물질 또는 다른 환경 스트레스제에 노출된 배양 된 세포 및 조직에서 DNA 손상을 평가하는 수단으로 점점 더 많이 사용된다1. 이 분석은 불완전한 DNA 복구와 관련되었던 DNA 이중 및 단 하나 물가 휴식, 알칼리-labile 병변 및 단 하나 물가 나누기를 검출할 수 있습니다. 국제항암제 시험용 인체사용기술요건의 조화(ICH) 가이드라인은 생체내 유독성 평가를 위한 설치류 적혈구 미세핵분석실험을 보충하기 위한 제2시험으로서 혜성분석과 같은 DNA 가닥 파괴 분석실험을 권고하고, 종양유도2의표적기관에서의 행동모드를 평가하기 위한 후속검사로 한다. 유럽식품안전청(EFSA)은 생체외 유독성 시험3에서 양성 결과의 관련성을 조사하기 위한 적절한 후속 시험으로서 생체 내 혜성 분석기를3권장한다. 2014년, 설치류 혜성 분석실험에 대한 OECD 시험 지침이 승인되어, 따라서 게노독성 전위내성의 규제 시험에 사용하기 위한 분석법의 수용성을 증가시킨다. 분석은 용해 된 세포의 핵에서 이동하는 이완된 DNA 루프 및 파편의 전기 동화성 분리에 근거를 두었습니다. 기본적으로, 단 하나 세포는 현미경 슬라이드에 겹쳐진 agarose에 내장됩니다. 슬라이드는 다음 알칼리성 (pH > 13) 솔루션 다음에 용해 버퍼에 침지, 단단히 코일 핵 DNA가 이완하고 긴장을 풀 수 있습니다. 슬라이드는 다음 양극을 향해 음전하 DNA의 이동을 자극하는 전기장에 배치, 혜성을 닮은 이미지를 만드는; 혜성 머리와 비교된 혜성 꼬리에 있는 DNA의 상대적인 양은 DNA 손상의 양에 정비례합니다; 꼬리의 DNA 함량은 전형적으로 디지털 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화됩니다.
혜성 분석이 단편화된 DNA를 검출하기 때문에, 노출 유도된 DNA 손상의 정확한 정량화는 처리 유도된 세포 독성 또는 긴장에서 유래한 괴사 또는 세포자멸과 관련되었던 염색질 단편화에 의해 혼동될 수 있습니다. 또한, DNA 손상은 기계적 전단 또는 부적절한 시료 처리의 결과로 발생할 수 있습니다4. DNA 손상의 기준선 수준을 최소화하기 위해 슬라이드 준비 전에 냉각 된 수확 된 조직을 유지하는 것이 이전에5,,6으로입증되었습니다. 많은 실험실은 신선한 조직에서 혜성 분석 슬라이드를 준비; 그러나, 이것은 동물의 다수를 가진 연구 결과에 있는 동물 당 다중 조직 모형에서 슬라이드를 준비할 때 물류적으로 도전적일 수 있습니다. 또한, 이것은 슬라이드 준비 및 분석이 원격 실험실에서 발생할 때 문제를 제시, 샘플의 선적을 필요로. 예를 들어, 미국 국립 독성학 프로그램은 혜성 분석물질을 그 유전독성시험 프로그램(https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html)의 성분으로 포함하며, 때로는 28일 또는 90일 반복 투여량 독성 연구에 분석결과를 통합한다; 이것은 생활 실험실에 의하여 조직의 수집및 분석을 위한 다른 실험실에 견본의 전송을 필요로 합니다. 이를 달성하기 위해, 조직 조각은 다진, 및 /또는 위장관의 상피 세포는 긁어 및 세포 현탁액은 분석7까지수신 실험실에 의해 후속 선적 및 저장을위한 냉동및 냉동에 저장된다. 시료의 적절한 취급은 냉동 조직을 사용하여 고품질의 데이터를 얻는 데 중요합니다. 그러나, 끊임없이 변화하는 인원에 의해 수행된 부검 도중 조직 견본의 재현가능한 조작은 통제하기 어렵습니다, 특히 혜성 분석사를 위한 조직을 일상적으로 수확하지 않는 생활 실험실에서. 부검 직원의 재교육 또는 신선하거나 냉동 된 조직 샘플을 수집하기 위해 숙련 된 실험실 직원이 근무하는 모바일 유닛의 사용은 종종 너무 비싸거나 실현 가능하지 않거나 단순히 과소 평가됩니다.
혜성 분석 분석을 위한 원격 부위로의 이송을 위한 고품질 조직 샘플의 일관된 생성을 더 잘 보장하기 위해, 조직의 플래시 냉동 큐브로부터 조직 보존의 출판 방법6의 유용성을 탐구하였다. 이 방법에서, 조직의 동결된 큐브는 콜드 버퍼를 함유하는 미세원원원지 튜브에 배치되는 스테인레스 스틸 조직 채굴장치(도 1)에적재된다. 조직의 큐브는 장치의 끝에있는 작은 게이지 메쉬를 통해 밀어 넣습니다. 반복적으로 메쉬 체를 통해 여러 번 양방향으로 조직 현탁액을 강제하면 비교적 균일한 단일 세포 현탁액을 초래한다. 이 방법으로 제조된 샘플은 다진 에 의해 제조된 신선 및 냉동 조직 샘플 모두에 품질면에서 유리하게 비교하였다. 추가 혜택으로, 다진 샘플과는 달리, 조직 큐브는 오랜 시간 동안 냉동 저장 될 수 있으며 여전히 혜성 분석에서 높은 품질의 결과를 산출.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전에 입증된 바와 같이7,,12,,13,제대로 처리된 플래시 냉동 다진 조직은 혜성 분석에서 좋은 결과를 제공한다. 사실, 우리의 실험실에서 제조 된 냉동 다진 쥐와 마우스 간을위한 기준 % 꼬리 DNA 값은 일반적으로 ≤6 %, 새로 다진 쥐 간 샘플에 대한 OECD 테스트 지침9에 의해 권장. 좋은 결과 다진 하 고 냉동 저?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 링컨 마틴과 켈리 오웬스에게 혜성 슬라이드를 준비하고 채점하는 전문 기술 지원을 위해 빚을 지고 있으며, 캐롤 스와츠 박사는 통계 분석을 수행합니다. 저자는 또한 ILS에 있는 유전 독물학, 조사 독물학 및 necropsy 프로그램의 일원의 지원 기여를 인정합니다.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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