Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade
Summary
Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.
Abstract
De komeettest wint aan populariteit als middel om DNA-schade in gekweekte cellen en weefsels te beoordelen, met name na blootstelling aan chemicaliën of andere milieustressoren. Het gebruik van de komeettest bij regelgevingstests op genotoxische mogelijkheden bij knaagdieren is in 2014 ingegeven door de goedkeuring van een testrichtlijn van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO). Komeettestdia’s worden meestal bereid uit vers weefsel op het moment van obductie; echter, bevriezing weefsel monsters kunnen voorkomen dat logistieke uitdagingen in verband met gelijktijdige voorbereiding van dia’s van meerdere organen per dier en van veel dieren per studie. Het invriezen maakt het ook mogelijk om monsters van de blootstellingsfaciliteit naar een ander laboratorium te verzenden voor analyse, en de opslag van bevroren weefsel vergemakkelijkt het uitstellen van een beslissing om DNA-schadegegevens voor een bepaald orgaan te genereren. De alkalische komeettest is nuttig voor het detecteren van blootstelling-gerelateerde DNA dubbele en single-streng pauzes, alkali-labiele laesies, en streng breekt geassocieerd met onvolledige DNA excisie reparatie. Echter, DNA-schade kan ook het gevolg zijn van mechanische scheren of onjuiste monster verwerking procedures, verstoren de resultaten van de test. Reproduceerbaarheid bij het verzamelen en verwerken van weefselmonsters tijdens de obductie kan moeilijk te controleren zijn als gevolg van fluctuerend laboratoriumpersoneel met wisselende ervaring in het oogsten van weefsels voor de komeettest. Het verbeteren van de consistentie door bijscholing of inzet van mobiele eenheden met ervaren laboratoriumpersoneel is kostbaar en mogelijk niet altijd haalbaar. Om consistente generatie van hoogwaardige monsters voor komeettestanalyse te optimaliseren, werd een methode geëvalueerd voor het homogeniseren van flash diepgevroren kubussen van weefsel met behulp van een aangepast weefselsnijdend apparaat. Monsters die met deze methode voor de komeettest zijn bereid, vergeleken in kwaliteit gunstig in kwaliteit met verse en bevroren weefselmonsters die tijdens de obductie worden geprikt. Bovendien werd een lage DNA-schade bij de uitgangswaarde gemeten in cellen van bevroren kubussen van weefsel na langdurige opslag.
Introduction
De komeettest wordt steeds vaker gebruikt als middel om DNA-schade te evalueren in gekweekte cellen en weefsels die worden blootgesteld aan chemicaliën of andere milieustressoren1. De test kan detecteren DNA dubbele- en single-streng pauzes, alkali-galiele laesies, en single-streng pauzes geassocieerd met onvolledige DNA-reparatie. De richtsnoer van de Internationale Raad voor harmonisatie van de technische voorschriften voor farmaceutische producten voor menselijk gebruik (ICH) beveelt een DNA-strengbreuk zoals de komeettest aan als een tweede test ter aanvulling van de micronucleustest van knaagdieren voor de beoordeling van in vivo genotoxiciteit en als vervolgtest voor de beoordeling van de werkingswijze in doelorganen van tumorinductie2. De Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) beveelt de in vivo komeettest aan als een geschikte follow-uptest om de relevantie van een positief resultaat in een in vitro genotoxiciteitstest te onderzoeken3. In 2014 werd een OESO-testrichtlijn goedgekeurd voor de test van de knaagdierkomeet, waardoor de aanvaardbaarheid van de test voor gebruik bij het testen van genotoxische stoffen in de regelgeving werd verhoogd. De test is gebaseerd op de elektroforetische scheiding van ontspannen DNA-lussen en fragmenten die migreren uit nucleoids van lysed cellen. Kortom, enkele cellen zijn ingebed in agarose die is gelaagd op microscoop dia’s. Dia’s worden vervolgens ondergedompeld in lysis buffer gevolgd door een alkalische (pH > 13) oplossing, die het mogelijk maakt de strak opgerolde nucleaire DNA te ontspannen en te ontspannen. Dia’s worden dan geplaatst in een elektrisch veld, dat migratie van negatief geladen DNA naar de anode stimuleert, waardoor beelden ontstaan die lijken op kometen; de relatieve hoeveelheid DNA in de komeetstaart in vergelijking met de komeetkop is rechtstreeks evenredig met de hoeveelheid DNA-schade; DNA-inhoud in de staart wordt meestal gekwantificeerd met behulp van digitale imaging software.
Omdat de komeettest gefragmenteerd DNA detecteert, kan nauwkeurige kwantificering van door blootstelling veroorzaakte DNA-schade worden verward met chromatinefragmentatie geassocieerd met necrose of apoptose als gevolg van door de behandeling veroorzaakte cytotoxiciteit of stress. Bovendien kan DNA-schade optreden als gevolg van mechanische afschuiaal of onjuiste monsterverwerking4. Het belang van het behoud van geoogst weefsel gekoeld voorafgaand aan dia voorbereiding om de basislijn niveau van DNA-schade te minimaliseren is eerder aangetoond5,6. Vele laboratoria bereiden komeettestdia’s van vers weefsel; Dit kan echter logistiek uitdagend zijn bij het voorbereiden van dia’s van meerdere weefseltypen per dier in een studie met een groot aantal dieren. Bovendien vormt dit een probleem wanneer diavoorbereiding en -analyse zich in een extern laboratorium moeten voordoen, waardoor de verzending van monsters noodzakelijk is. Bijvoorbeeld, het Amerikaanse National Toxicology Program bevat de komeet test als onderdeel van haar genetische toxicologie testen programma (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) en soms bevat de test in 28 of 90 dagen herhalen dosis toxiciteit studies; dit vereist het verzamelen van weefsel door het in-life laboratorium en de overdracht van monsters naar een ander laboratorium voor analyse. Om dit te bereiken, worden weefselstukken gehakt, en/of epitheelcellen van het maag-darmkanaal worden geschraapt en cellulaire suspensuspensie worden flash bevroren en opgeslagen in een vriezer voor latere verzending en opslag door het ontvangende laboratorium tot analyse7. Een goede behandeling van monsters is van cruciaal belang voor het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit met behulp van bevroren weefsel; echter, reproduceerbare manipulatie van weefselmonsters tijdens necropsies uitgevoerd door steeds veranderende personeel is moeilijk te controleren, vooral bij in-life laboratoria die niet routinematig oogsten weefsels voor de komeet test. Opfristraining van obductiepersoneel of het gebruik van een mobiele eenheid die wordt bemand door ervaren laboratoriumpersoneel om verse of bevroren weefselmonsters te verzamelen, is vaak te duur, niet haalbaar of gewoon ondergewaardeerd.
Om een consistente generatie van hoogwaardige weefselmonsters beter te garanderen voor overdracht naar een afgelegen locatie voor comettestanalyse, werd het nut van een gepubliceerde methode6 van weefselbehoud van vlambevroren kubussen van weefsel onderzocht. Bij deze methode worden bevroren blokjes weefsel geladen in een roestvrijstalen weefselverwikringsapparaat (figuur 1) dat in een microcentrifugebuis met koude buffer wordt geplaatst. De kubus van weefsel wordt vervolgens geduwd door een kleine meter gaas aan het einde van het apparaat. Herhaaldelijk dwingen van het weefsel suspensie door de mesh zeef in beide richtingen meerdere malen resulteert in een relatief uniforme eencellige suspensie. Monsters bereid door deze methode gunstig in kwaliteit vergeleken met zowel verse als bevroren weefsel monsters bereid door hakken. Als bijkomend voordeel, in tegenstelling tot gehakte monsters, kunnen weefselkubussen gedurende langere tijd bevroren worden opgeslagen en nog steeds resultaten van hoge kwaliteit opleveren in de komeettest.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals eerder aangetoond7,12,13, goed behandeld flash bevroren gehakt weefsel biedt goede resultaten in de komeet test. In feite zijn de DNA-waarden van de basislijn % staart voor bevroren gehakte ratten- en muizenlever die in ons laboratorium worden bereid, doorgaans ≤6%, zoals aanbevolen door de OESO-testrichtlijn9 voor vers gehakte rattenlevermonsters. Er zijn goede resultaten behaald door meerdere la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn schatplichtig aan Lincoln Martin en Kelley Owens voor deskundige technische bijstand voorbereiden en scoren komeet dia’s en Dr Carol Swartz voor het uitvoeren van statistische analyses. De auteurs erkennen ook de ondersteunende bijdragen van leden van de genetische toxicologie, onderzoekstoxicologie en obductie programma’s op ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
