डीएनए क्षति के मूल्यांकन के लिए धूमकेतु परख में जमे हुए ऊतक का उपयोग
Summary
यह प्रोटोकॉल डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए धूमकेतु परख में उपयोग के लिए नेक्रॉप्सी के समय उच्च गुणवत्ता वाले जमे हुए ऊतक नमूनों को तैयार करने के लिए कई प्रक्रियाओं का वर्णन करता है: 1) कीमा बनाया हुआ ऊतक, 2) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट से एपिथेलियल कोशिकाओं को स्क्रैप किया गया है, और 3) क्यूबड ऊतक नमूने, एक ऊतक कीमा बनाने वाले उपकरण का उपयोग कर समरूपता की आवश्यकता होती है।
Abstract
धूमकेतु परख सुसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतकों में डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए एक साधन के रूप में लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है, विशेष रूप से रसायनों या अंय पर्यावरणीय तनाव के लिए जोखिम के बाद । कृंतकमें जीनोटॉक्सिक क्षमता के लिए नियामक परीक्षण में धूमकेतु परख का उपयोग २०१४ में आर्थिक सहयोग और विकास संगठन (ओईसीडी) परीक्षण दिशानिर्देश को अपनाने से प्रेरित किया गया है । धूमकेतु परख स्लाइड आम तौर पर necropsy के समय ताजा ऊतक से तैयार कर रहे हैं; हालांकि, ठंड ऊतक के नमूने प्रति पशु कई अंगों और अध्ययन के अनुसार कई जानवरों से स्लाइड की एक साथ तैयारी के साथ जुड़े साजो-सामान की चुनौतियों से बच सकते हैं । ठंड भी विश्लेषण के लिए एक अलग प्रयोगशाला के लिए जोखिम सुविधा से शिपिंग नमूनों को सक्षम बनाता है, और जमे हुए ऊतक के भंडारण के लिए एक दिए गए अंग के लिए डीएनए क्षति डेटा उत्पन्न करने का निर्णय आस्थगित की सुविधा । क्षारीय धूमकेतु परख जोखिम से संबंधित डीएनए डबल और एकल कतरा टूटता है, क्षार-labile घावों, और स्ट्रैंड अधूरा डीएनए उत्तेजना की मरंमत के साथ जुड़े टूट का पता लगाने के लिए उपयोगी है । हालांकि, डीएनए क्षति यांत्रिक बाल काटना या अनुचित नमूना प्रसंस्करण प्रक्रियाओं से भी परिणाम हो सकता है, परख के परिणामों को भ्रमित कर सकता है। नेक्रॉप्सी के दौरान ऊतक के नमूनों के संग्रह और प्रसंस्करण में प्रजनन क्षमता धूमकेतु परख के लिए ऊतकों की कटाई में अनुभव के विभिन्न स्तरों के साथ अस्थिर प्रयोगशाला कर्मियों के कारण नियंत्रण करने के लिए मुश्किल हो सकती है। रिफ्रेशर प्रशिक्षण या अनुभवी प्रयोगशाला कर्मियों के साथ कर्मचारियों की तैनाती के माध्यम से स्थिरता बढ़ाना महंगा है और हमेशा संभव नहीं हो सकता है । धूमकेतु परख विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों की लगातार पीढ़ी को अनुकूलित करने के लिए, एक अनुकूलित ऊतक कीमा बनाने वाले उपकरण का उपयोग करके ऊतक के फ्लैश फ्रोजन क्यूब्स को समरूप करने के लिए एक विधि का मूल्यांकन किया गया था। इस विधि द्वारा धूमकेतु परख के लिए तैयार नमूने ताजा और जमे हुए ऊतक necropsy के दौरान कीमा द्वारा तैयार नमूनों के लिए गुणवत्ता में कृपापूर्वक तुलना की । इसके अलावा, लंबे समय तक भंडारण के बाद ऊतक के जमे हुए क्यूब्स से कोशिकाओं में कम बेसलाइन डीएनए क्षति मापा गया था ।
Introduction
धूमकेतु परख का उपयोग सुसंस्कृत कोशिकाओं और रसायनों या अन्य पर्यावरणीयतनावोंके संपर्क में आने वाले ऊतकों में डीएनए क्षति का मूल्यांकन करने के साधन के रूप में किया जाता है । परख डीएनए डबल और एकल कतरा टूटता है, क्षार-labile घावों, और एक ही कतरा अधूरा डीएनए मरम्मत के साथ जुड़े टूट का पता लगा सकते हैं । दवा परीक्षण के लिए फार्मास्यूटिकल्स फॉर ह्यूमन यूज (आईसीएच) दिशानिर्देश के लिए तकनीकी आवश्यकताओं के सामंजस्य के लिए अंतर्राष्ट्रीय परिषद ने वीवो जीनोमिकिटी में आकलन करने के लिए कृंतक एरिथ्रोसाइट माइक्रोन्यूकलस परख को पूरक करने के लिए एक दूसरे परीक्षण के रूप में धूमकेतु परख के रूप में डीएनए स्ट्रैंड टूटना परख की सिफारिश की है और ट्यूमर इंडक्शन2के लक्षित अंगों में कार्रवाई के तरीके का आकलन करने के लिए अनुवर्ती परीक्षण के रूप में । यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण (EFSA) एक इन विट्रो जीनोटॉक्सिकिटी टेस्ट3में एक सकारात्मक परिणाम की प्रासंगिकता की जांच के लिए एक उपयुक्त अनुवर्ती परीक्षण के रूप में वीवो धूमकेतु परख में सिफारिश की । २०१४ में, कृंतक धूमकेतु परख के लिए एक ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश को मंजूरी दी गई थी, इस प्रकार जीनोटॉक्सिक क्षमता के नियामक परीक्षण में उपयोग के लिए परख की स्वीकार्यता में वृद्धि हुई । यह परख आराम से डीएनए छोरों और टुकड़ों के इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण पर आधारित है जो lysed कोशिकाओं के नाभिक से स्थानांतरित होते हैं । असल में, एकल कोशिकाएं अगारोज में एम्बेडेड हैं जिन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्तरित किया गया है। स्लाइड्स में इसके बाद लिसिस बफर में डूब जाता है और उसके बाद क्षारीय (पीएच एंड जीटी;13) समाधान होता है, जो कसकर कुंडलित परमाणु डीएनए को आराम और खोलना की अनुमति देता है । स्लाइड तो एक बिजली के क्षेत्र में रखा जाता है, जो एनोड की ओर नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए के प्रवास को उत्तेजित करता है, छवियों है कि धूमकेतु के समान बनाने; धूमकेतु सिर की तुलना में धूमकेतु पूंछ में डीएनए की सापेक्ष राशि सीधे डीएनए क्षति की मात्रा के आनुपातिक है; पूंछ में डीएनए सामग्री आम तौर पर डिजिटल इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित है।
क्योंकि धूमकेतु परख खंडित डीएनए का पता लगाता है, जोखिम प्रेरित डीएनए क्षति के सटीक मात्राकरण उपचार प्रेरित साइटोटॉक्सिकिसिटी या तनाव के परिणामस्वरूप नेक्रोसिस या एपोप्टोसिस से जुड़े क्रोमेटिन विखंडन से चकित किया जा सकता है । इसके अलावा, डीएनए क्षति यांत्रिक बाल काटना या अनुचित नमूना प्रसंस्करण4के परिणामस्वरूप हो सकता है । डीएनए क्षति के आधारभूत स्तर को कम करने के लिए तैयारी करने से पहले काटे गए ऊतकों को ठंडा बनाए रखने का महत्व पहले5,6का प्रदर्शन किया गया है । कई प्रयोगशालाओं ताजा ऊतक से धूमकेतु परख स्लाइड तैयार; हालांकि, बड़ी संख्या में जानवरों के साथ अध्ययन में प्रति जानवर कई ऊतक प्रकार ों से स्लाइड तैयार करते समय यह रसद चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, यह एक समस्या प्रस्तुत करता है जब स्लाइड तैयारी और विश्लेषण के लिए एक दूरदराज के प्रयोगशाला में होते हैं, नमूनों की शिपमेंट की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, अमेरिका के राष्ट्रीय विष विज्ञान कार्यक्रम अपने आनुवंशिक विष विज्ञान परीक्षण कार्यक्रम (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) के एक घटक के रूप में धूमकेतु परख भी शामिल है और कई बार 28 या ९० दिन दोहराने खुराक विषाक्तता अध्ययन में परख शामिल; इसके लिए इन-लाइफ प्रयोगशाला द्वारा ऊतकों का संग्रह और विश्लेषण के लिए नमूनों को दूसरी प्रयोगशाला में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है। इसे पूरा करने के लिए, ऊतक के टुकड़े कीमा बनाए जाते हैं, और/या गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट की एपिथेलियल कोशिकाओं को स्क्रैप किया जाता है और सेलुलर निलंबन को फ्लैश फ्रीज कर दिया जाता है और विश्लेषण7तक प्राप्त प्रयोगशाला द्वारा बाद में शिपमेंट और भंडारण के लिए फ्रीजर में संग्रहीत किया जाता है । जमे हुए ऊतकों का उपयोग करउच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए नमूनों की उचित हैंडलिंग महत्वपूर्ण है; हालांकि, कभी बदलते कर्मियों द्वारा किए गए नेक्रॉप्स के दौरान ऊतक नमूनों के प्रजनन योग्य हेरफेर को नियंत्रित करना मुश्किल है, विशेष रूप से इन-लाइफ प्रयोगशालाओं में जो नियमित रूप से धूमकेतु परख के लिए ऊतकों को फसल नहीं करते हैं। नेक्रॉप्सी कर्मचारियों का रिफ्रेशर प्रशिक्षण या अनुभवी प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा ताजा या जमे हुए ऊतक नमूनों को एकत्र करने के लिए कर्मचारियों की एक मोबाइल इकाई का उपयोग अक्सर बहुत महंगा होता है, संभव नहीं होता है, या बस इसका सही मूल्यांकन नहीं होता है।
बेहतर धूमकेतु परख विश्लेषण के लिए एक दूरदराज के स्थल पर स्थानांतरित करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक नमूनों की लगातार पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक के फ्लैश जमे हुए क्यूब्स से ऊतक संरक्षण के एक प्रकाशित विधि6 की उपयोगिता का पता लगाया गया था । इस विधि में, ऊतक के जमे हुए क्यूब्स को स्टेनलेस स्टील टिश्यू कीमा बनाने वाले उपकरण(चित्रा 1)में लोड किया जाता है जिसे ठंडे बफर युक्त माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में रखा जाता है। ऊतक के घन तो डिवाइस के अंत में एक छोटे से गेज जाल के माध्यम से धक्का दिया है । बार-बार दोनों दिशाओं में जाल छलनी के माध्यम से ऊतक निलंबन को मजबूर करना कई बार अपेक्षाकृत समान एकल सेल निलंबन में परिणाम देता है। इस विधि द्वारा तैयार नमूने गुणवत्ता में कृपापूर्वक दोनों ताजा और जमे हुए ऊतक कीमा द्वारा तैयार नमूनों की तुलना में । एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, कीमा बनाया हुआ नमूनों के विपरीत, ऊतक क्यूब्स समय की लंबी अवधि के लिए जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है और अभी भी धूमकेतु परख में उच्च गुणवत्ता के परिणाम उपज ।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि पहले7,,12,,13का प्रदर्शन किया गया था, ठीक से संभाला फ्लैश जमे हुए कीमा बनाया हुआ ऊतक धूमकेतु परख में अच्छे परिणाम प्रदान करता है। वास्तव में, हमारी प्रयोगशाला में ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ों को विशेषज्ञ तकनीकी सहायता की तैयारी और धूमकेतु स्लाइड स्कोरिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन के लिए डॉ कैरोल Swartz के लिए लिंकन मार्टिन और Kelley Owens के ऋणी हैं । लेखक आईएलएस में जेनेटिक टॉक्सिकोलॉजी, खोजी विष विज्ञान और नेक्रॉप्सी कार्यक्रमों के सदस्यों के सहायक योगदान को भी स्वीकार करते हैं।
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
