Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA
Summary
Questo protocollo descrive diverse procedure per la preparazione di campioni di tessuto congelato di alta qualità al momento della necroscopia per l’uso nel saggio della cometa per valutare il danno al DNA: 1) tessuto macinato, 2) cellule epiteliali raschiate dal tratto gastrointestinale e 3) tessuto immatolato campioni, richiedendo l’omogeneizzazione utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti.
Abstract
L’analisi della cometa sta guadagnando popolarità come mezzo per valutare il danno del DNA nelle cellule e nei tessuti coltivati, in particolare dopo l’esposizione a sostanze chimiche o altri fattori di stress ambientali. L’uso del saggio della cometa nei test normativi per il potenziale genotossico nei roditori è stato guidato dall’adozione di una linea guida di prova dell’Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) nel 2014. Cometa sdolcino i vetrini sono tipicamente preparati da tessuto fresco al momento della necropsia; tuttavia, il congelamento dei campioni di tessuto può evitare le sfide logistiche associate alla preparazione simultanea di vetrini da più organi per animale e da molti animali per studio. Il congelamento consente inoltre la spedizione di campioni dall’impianto di esposizione a un altro laboratorio per l’analisi, e lo stoccaggio di tessuto congelato facilita il rinvio della decisione di generare dati sui danni al DNA per un determinato organo. Il saggio di cometa alcalina è utile per rilevare le rotture del DNA a doppio e singolo filamento correlate all’esposizione, le lesioni alcali-labile e le rotture del filamento associate alla riparazione incompleta dell’escissione del DNA. Tuttavia, il danno al DNA può anche derivare da una tosatura meccanica o da procedure di elaborazione del campione improprie, confondendo i risultati del test. La riproducibilità nella raccolta e nella lavorazione di campioni di tessuto durante le necroscopia può essere difficile da controllare a causa della fluttuazione del personale di laboratorio con diversi livelli di esperienza nella raccolta dei tessuti per il saggio della cometa. Migliorare la coerenza attraverso la formazione di aggiornamento o l’impiego di unità mobili con personale di laboratorio esperto è costoso e potrebbe non essere sempre fattibile. Per ottimizzare la generazione coerente di campioni di alta qualità per l’analisi del saggio della cometa, è stato valutato un metodo per omogeneizzare i cubi congelati flash di tessuto utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti personalizzato. I campioni preparati per il test della cometa con questo metodo sono stati confrontati favorevolmente in termini di qualità a campioni di tessuto fresco e congelato preparati dalla maciazione durante la necropsia. Inoltre, il basso danno del DNA di base è stato misurato in cellule da cubetti congelati di tessuto dopo un accumulo prolungato.
Introduction
Il test della cometa è sempre più usato come mezzo per valutare il danno del DNA nelle cellule coltivate e nei tessuti esposti a sostanze chimiche o altri fattori di stress ambientali1. L’analisi è in grado di rilevare rotture a doppio e singolo filamento del DNA, lesioni alcali-labili e rotture a singolo filamento associate alla riparazione incompleta del DNA. L’International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guideline for Pharmaceutical testing raccomanda una rottura del filamento di DNA, come il saggio della cometa come secondo test per integrare il micronucleo eritrocite del roditore per la valutazione della genotossicità in vivo e come test di follow-up per valutare la modalità di azione degli organi nel bersaglio di induzione tumorale2. L’Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) raccomanda il test della cometa in vivo come test di follow-up adeguato per studiare la pertinenza di un risultato positivo in un test di genotossicità in vitro3. Nel 2014 è stata approvata una linea guida per i test dell’OCSE per il test della cometa sui roditori, aumentando così l’accettabilità del saggio da utilizzare nei test normativi del potenziale genotossico. Il saggio si basa sulla separazione elettroforetica di loop di DNA rilassati e frammenti che migrano dai nucleoidi delle cellule lisci. Fondamentalmente, singole cellule sono incorporate in agarose che è stato stratificato su vetrini al microscopio. I vetrini vengono poi immersi nel buffer di lisi seguita da una soluzione alcalina (pH > 13), che consente al DNA nucleare strettamente arrotolato di rilassarsi e rilassarsi. Le diapositive vengono poi collocate in un campo elettrico, che stimola la migrazione del DNA caricato negativamente verso l’anodo, creando immagini che assomigliano alle comete; la quantità relativa di DNA nella coda della cometa rispetto alla testa della cometa è direttamente proporzionale alla quantità di danno del DNA; Il contenuto di DNA nella coda viene in genere quantificato utilizzando un software di imaging digitale.
Poiché il saggio della cometa rileva il DNA frammentato, la quantificazione accurata del danno del DNA indotto dall’esposizione può essere confusa dalla frammentazione della cromatina associata alla necrosi o all’apoptosi derivante dalla citotossicità o dallo stress indotta dal trattamento. Inoltre, il danno al DNA può verificarsi a causa di tosatura meccanica o elaborazione impropria del campione4. L’importanza di mantenere il tessuto raccolto raffreddato prima della preparazione dello scivolo per ridurre al minimo il livello di base del danno al DNA è stata precedentemente dimostrata5,6. Molti laboratori preparano scivoli di assaggio cometa da tessuti freschi; tuttavia, questo può essere logisticamente impegnativo quando si preparano diapositive da più tipi di tessuto per animale in uno studio con un gran numero di animali. Inoltre, questo presenta un problema quando la preparazione e l’analisi delle diapositive devono avvenire in un laboratorio remoto, che richiede la spedizione di campioni. Ad esempio, il National Toxicology Program degli Stati Uniti include il saggio della cometa come componente del suo programma di test di tossicologia genetica (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) e talvolta incorpora il saggio in studi di tossicità a dose ripetuta di 28 o 90 giorni; ciò richiede la raccolta di tessuti da parte del laboratorio in vita e il trasferimento di campioni in un altro laboratorio per l’analisi. Per raggiungere questo obiettivo, i pezzi di tessuto vengono macinati e/o le cellule epiteliali del tratto gastrointestinale vengono raschiate e le sospensioni cellulari vengono congelate flash e conservate in un congelatore per la successiva spedizione e conservazione da parte del laboratorio ricevente fino all’analisi7. Una corretta gestione dei campioni è fondamentale per ottenere dati di alta qualità utilizzando tessuti congelati; tuttavia, la manipolazione riproducibile di campioni di tessuto durante le necropsie eseguite da personale in continua evoluzione è difficile da controllare, soprattutto nei laboratori in vita che non raccolgono regolarmente tessuti per il saggio della cometa. La formazione di aggiornamento del personale necropy o l’uso di un’unità mobile composta da personale di laboratorio esperto per raccogliere campioni di tessuto freschi o congelati è spesso troppo costosa, non fattibile o semplicemente sottovalutata.
Per garantire una migliore generazione coerente di campioni di tessuto di alta qualità per il trasferimento in un sito remoto per l’analisi del test della cometa, è stata esplorata l’utilità di un metodo pubblicato6 di conservazione dei tessuti da cubi di tessuto congelati flash. In questo metodo, i cubetti di tessuto congelati vengono caricati in un dispositivo di mintura del tessuto in acciaio inossidabile (Figura 1) che viene collocato in un tubo di microcentrifuga contenente tampone freddo. Il cubo di tessuto viene quindi spinto attraverso una piccola rete di calibro alla fine del dispositivo. Forzando ripetutamente la sospensione del tessuto attraverso il setaccio di maglia in entrambe le direzioni più volte si traduce in una sospensione a cella singola relativamente uniforme. I campioni preparati con questo metodo confrontano favorevolmente la qualità acampioni di tessuto fresco e congelato preparati mediante la macidia. Come ulteriore vantaggio, a differenza dei campioni macinati, i cubi di tessuto possono essere conservati congelati per periodi prolungati di tempo e ancora producono risultati di alta qualità nel saggio della cometa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come dimostrato in precedenza7,12,13, correttamente gestito flash tessuto macinato congelato fornisce buoni risultati nel test cometa. Infatti, i valori del DNA della coda % di base per il ratto macinato congelato e il fegato di topo preparati nel nostro laboratorio sono in genere ,6%, come raccomandato dalla guida del test dell’OCSE9 per campioni di fegato di ratto appena macinato. Buoni risultati sono s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono in debito con Lincoln Martin e Kelley Owens per l’assistenza tecnica esperta nella preparazione e nel punteggio delle diapositive della cometa e della dott.ssa Carol Swartz per l’esecuzione di analisi statistiche. Gli autori riconoscono anche i contributi di supporto dei membri dei programmi di tossicologia genetica, tossicologia investigativa e necropsia presso ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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