Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA
Summary
Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.
Abstract
O ensaio do cometa está ganhando popularidade como um meio de avaliar os danos do DNA em células e tecidos cultivados, particularmente após a exposição a produtos químicos ou outros estressores ambientais. O uso do ensaio do cometa em testes regulatórios para potencial genotóxico em roedores foi impulsionado pela adoção de uma diretriz de teste da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) em 2014. Os slides de ensaio de cometasão normalmente preparados a partir de tecido fresco no momento da necropsia; no entanto, o congelamento de amostras de tecidos pode evitar desafios logísticos associados à preparação simultânea de slides de múltiplos órgãos por animal e de muitos animais por estudo. O congelamento também permite o envio de amostras da instalação de exposição para um laboratório diferente para análise, e o armazenamento de tecido congelado facilita o adiamento da decisão de gerar dados de danos de DNA para um determinado órgão. O ensaio de cometa alcalino é útil para detectar quebras de DNA de dna e fio único relacionados à exposição, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios associadas com o reparo incompleto da excisão do DNA. No entanto, os danos no DNA também podem resultar de procedimentos mecânicos de cisalhamento ou processamento de amostras inadequados, confundindo os resultados do ensaio. A reprodutibilidade na coleta e processamento de amostras de tecidos durante necropsias pode ser difícil de controlar devido à flutuação de pessoal de laboratório com diferentes níveis de experiência na colheita de tecidos para o ensaio do cometa. Aumentar a consistência através do treinamento de atualização ou implantação de unidades móveis com pessoal de laboratório experiente é caro e nem sempre pode ser viável. Para otimizar a geração consistente de amostras de alta qualidade para análise de ensaios de cometas, foi avaliado um método para homogeneizar cubos de tecido congelados flash usando um dispositivo de picar tecido personalizado. Amostras preparadas para o ensaio do cometa por este método comparadas favoravelmente em qualidade a amostras de tecido fresco e congelado preparadas por picar durante a necropsia. Além disso, o dano baixo do DNA da linha de base foi medido em células de cubos congelados de tecido após armazenamento prolongado.
Introduction
O ensaio do cometa é cada vez mais usado como um meio de avaliar os danos do DNA em células cultivadas e tecidos expostos a produtos químicos ou outros estressores ambientais1. O ensaio pode detectar quebras de DNA duplo e único, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios únicos associadas ao reparo incompleto do DNA. O Conselho Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para Medicamentos para Uso Humano (ICH) para testes farmacêuticos recomenda um ensaio de quebra de fios de DNA, como o ensaio do cometa como um segundo teste para complementar o ensaio do micronúcleo eritrócito de roedores para avaliação da genotoxicidade in vivo e como um teste de acompanhamento para avaliação do modo de ação em órgãos-alvo de indução de tumor2. A Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA) recomenda o ensaio do cometa in vivo como um teste de seguimento adequado para investigar a relevância de um resultado positivo em um teste de genotoxicidade in vitro3. Em 2014, uma diretriz de teste da OCDE foi aprovada para o ensaio do cometa roedor, aumentando assim a aceitação do ensaio para uso em testes regulatórios de potencial genotóxico. O ensaio é baseado na separação eletroforética de laços de DNA relaxados e fragmentos que migram de nucleóides de células lysed. Basicamente, células únicas estão embutidas em agarose que foi colocada em camadas em slides de microscópio. Os slides são então imersos em tampão de lyse seguido de uma solução alcalina (pH > 13), que permite que o DNA nuclear bem enrolado relaxe e descontraa. Os slides são então colocados em um campo elétrico, o que estimula a migração do DNA negativamente carregado em direção ao ânodo, criando imagens que se assemelham a cometas; a quantidade relativa de DNA na cauda do cometa em comparação com a cabeça do cometa é diretamente proporcional à quantidade de dano de DNA; O conteúdo de DNA na cauda é tipicamente quantificado usando software de imagem digital.
Como o ensaio do cometa detecta DNA fragmentado, a quantificação precisa de danos de DNA induzidos por exposição pode ser confundida pela fragmentação da cromatina associada à necrose ou apoptose resultante de citotoxicidade ou estresse induzidos pelo tratamento. Além disso, danos no DNA podem ocorrer como resultado de cisalhamento mecânico ou processamento inadequado da amostra4. A importância de manter o tecido colhido refrigerado antes da preparação do slide para minimizar o nível de base de dano de DNA foi previamente demonstrada5,6. Muitos laboratórios preparam slides de ensaio sinuosos de tecido fresco; no entanto, isso pode ser logisticamente desafiador ao preparar slides de múltiplos tipos de tecidos por animal em um estudo com um grande número de animais. Além disso, apresenta um problema quando a preparação e análise de slides devem ocorrer em um laboratório remoto, necessitando de remessa de amostras. Por exemplo, o Programa Nacional de Toxicologia dos EUA inclui o ensaio do cometa como um componente de seu programa de testes toxicológicos genéticos (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) e às vezes incorpora o ensaio em estudos de toxicidade de repetição de 28 ou 90 dias; isso requer a coleta de tecidos pelo laboratório em vida e a transferência de amostras para outro laboratório para análise. Para isso, as peças de tecido são picadas e/ou células epiteliais do trato gastrointestinal são raspadas e as suspensões celulares são congeladas e armazenadas em um congelador para posterior embarque e armazenamento pelo laboratório receptor até a análise7. O manuseio adequado das amostras é crucial para a obtenção de dados de alta qualidade utilizando tecido congelado; no entanto, a manipulação reprodutível de amostras de tecidos durante necropsias realizadas por pessoas em constante mudança é difícil de controlar, especialmente em laboratórios em vida que não coletam tecidos rotineiramente para o ensaio do cometa. O treinamento de atualização da equipe de necropsia ou o uso de uma unidade móvel com pessoal de laboratório experiente para coletar amostras de tecido fresco ou congelado é muitas vezes muito caro, inviável ou simplesmente desvalorizado.
Para garantir melhor a geração consistente de amostras de tecido de alta qualidade para transferência para um local remoto para análise de ensaios de cometas, foi explorada a utilidade de um método publicado6 de preservação de tecidos a partir de cubos de tecido congelados flash. Neste método, cubos congelados de tecido são carregados em um dispositivo de picar tecido de aço inoxidável(Figura 1) que é colocado em um tubo de microcentrífuga contendo tampão frio. O cubo de tecido é então empurrado através de uma pequena malha de bitola na extremidade do dispositivo. Forçar repetidamente a suspensão do tecido através da peneira de malha em ambas as direções várias vezes resulta em uma suspensão celular única relativamente uniforme. Amostras preparadas por este método comparadas favoravelmente em qualidade a amostras de tecido fresco e congelado preparadas por picar. Como um benefício adicional, ao contrário das amostras picadas, os cubos de tecido podem ser armazenados congelados por períodos prolongados de tempo e ainda produzir resultados de alta qualidade no ensaio do cometa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como demonstrado anteriormente7,12,13, tecido picado congelado flash devidamente manuseado fornece bons resultados no ensaio do cometa. De fato, os valores de DNA da cauda % da linha de base para fígado de rato picado congelado e fígado de rato preparado em nosso laboratório são tipicamente ≤6%, conforme recomendado pela diretriz de teste da OCDE9 para amostras de fígado de rato recém-picado. Bons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores estão em dívida com Lincoln Martin e Kelley Owens por assistência técnica especializada preparando e pontuando slides de cometas e dr. Carol Swartz para a realização de análises estatísticas. Os autores também reconhecem as contribuições solidárias dos membros dos programas de Toxicologia Genética, Toxicologia Investigativa e Necropsia do ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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