Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК
Summary
Этот протокол описывает несколько процедур для подготовки высококачественных образцов замороженных тканей во время некропсии для использования в анализе кометы для оценки повреждения ДНК: 1) рубленая ткань, 2) Царапины эпителиальных клеток из желудочно-кишечного тракта, и 3) кубических тканей образцы, требующие гомогенизации с помощью устройства для измельчения тканей.
Abstract
Анализ кометы набирает популярность как средство оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, особенно после воздействия химических веществ или других экологических стрессоров. Использование анализа кометы в регулятивном тестировании генотоксического потенциала у грызунов было обусловлено принятием в 2014 году директивы Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР). Комета асссея слайды, как правило, готовятся из свежей ткани во время некропсии; однако, замораживание образцов тканей может избежать логистических проблем, связанных с одновременной подготовкой слайдов из нескольких органов на животное и от многих животных в исследовании. Замораживание также позволяет отгружать образцы из объекта воздействия в другую лабораторию для анализа, а хранение замороженных тканей облегчает отсрочку принятия решения о генерации данных о повреждении ДНК для данного органа. Анализ щелочной кометы полезен для обнаружения двух- и однострочных разрывов ДНК, щелочных лабильных поражений и разрывов нитей, связанных с неполным восстановлением иссечения ДНК. Тем не менее, повреждение ДНК может также в результате механических стрижки или неправильной обработки образцов процедур, смешивая результаты анализа. Воспроизводимость в сборе и обработке образцов тканей во время некропсии может быть трудно контролировать из-за колебания лабораторного персонала с различным уровнем опыта в сборе тканей для проверки кометы. Повышение согласованности путем повышения квалификации или развертывания мобильных подразделений, укомплектованных опытным лабораторным персоналом, сопряжено с большими расходами и не всегда может быть осуществимо. Для оптимизации последовательного поколения высококачественных образцов для анализа анализа анализа комет был оценен метод гомогенизации флэш-замороженных кубов ткани с помощью настраиваемого устройства для рубки тканей. Образцы, подготовленные для анализа кометы этим методом, по сравнению по качеству с образцами свежих и замороженных тканей, подготовленными путем измельчения во время некропсии. Кроме того, низкий базовый ущерб ДНК измерялся в клетках из замороженных кубов ткани после длительного хранения.
Introduction
Анализ кометы все чаще используется в качестве средства оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, подвергающихся воздействию химических веществ или других экологических стрессоров1. Анализ может обнаружить ДНК двух- и однострочных разрывов, щелочных лабильных поражений, и однострочные перерывы, связанные с неполным ремонтом ДНК. Международный совет по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для использования человека (ICH) руководство для фармацевтического тестирования рекомендует ДНК нити асссе, такие как анализ кометы в качестве второго теста в дополнение к грызунов эритроцита микронуклета анализа для оценки виво генотоксичности и в качестве последующего теста для оценки режима действия в целевых органов опухолиопухоли 2. Европейское управление по безопасности пищевых продуктов (EFSA) рекомендует анализ кометы in vivo в качестве подходящего последующего теста для исследования актуальности положительного результата в тесте по генококсикности in vitro3. В 2014 году было утверждено руководство ОЭСР по тестированию кометы грызунов, что увеличило приемлемость анализа для использования в регулятивном тестировании генотоксического потенциала. Анализ основан на электрофоретической разделении расслабленных циклов ДНК и фрагментов, которые мигрируют из нуклеоидов лизированных клеток. В основном, одиночные клетки встроены в агарозу, которая была слоистых на микроскоп слайды. Слайды затем погружаются в буфер лизиса, а затем щелочной (pH ) решение, которое позволяет плотно смоченной ядерной ДНК, чтобы расслабиться и расслабиться. Слайды затем помещаются в электрическое поле, которое стимулирует миграцию отрицательно заряженной ДНК к аноду, создавая изображения, напоминающие кометы; относительное количество ДНК в хвосте кометы по сравнению с головкой кометы прямо пропорционально количеству повреждений ДНК; Содержание ДНК в хвосте, как правило, количественно с помощью цифрового программного обеспечения изображений.
Поскольку анализ кометы обнаруживает фрагментированную ДНК, точная количественная количественная оценка повреждения ДНК, вызванного воздействием, может быть сбита с толку фрагментацией хроматина, связанной с некрозом или апоптозом в результате вызванной лечением цитотоксичности или стресса. Кроме того, повреждение ДНК может произойти в результате механической стрижки или неправильной обработки образцов4. Важность поддержания собранной ткани охлажденной до слайд-подготовки, чтобы свести к минимуму базовый уровень повреждения ДНК, ранее было продемонстрировано5,,6. Многие лаборатории готовят кометные асссивы слайдов из свежей ткани; однако, это может быть логистически сложной при подготовке слайдов из нескольких типов тканей на животное в исследовании с большим количеством животных. Кроме того, это создает проблему, когда подготовка и анализ слайдов должны происходить в удаленной лаборатории, что требует отгрузки образцов. Например, Национальная программа токсикологии США включает анализ кометы в качестве компонента своей программы тестирования на генетическую токсикологию (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html), а иногда включает анализ в 28 или 90 дней повторных исследований токсичности дозы; это требует сбора тканей лабораторией в течение всей жизни и передачи образцов в другую лабораторию для анализа. Для достижения этой цели, части ткани измельчаются, и / или эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта Царапины и клеточной суспензии флэш-заморожены и хранятся в морозильной камере для последующей отгрузки и хранения в приемной лаборатории до анализа7. Правильная обработка образцов имеет решающее значение для получения высококачественных данных с использованием замороженных тканей; однако, воспроизводимые манипуляции образцов тканей во время некропсии, выполняемые постоянно меняющимся персоналом, трудно контролировать, особенно в лабораториях в жизни, которые обычно не собирают ткани для анализа кометы. Освежающее обучение персонала по некропсии или использование мобильного подразделения, укомплектованного опытным лабораторным персоналом для сбора образцов свежих или замороженных тканей, зачастую является слишком дорогостоящим, неосуществимым или просто недооцененным.
Для лучшего обеспечения последовательного генерации высококачественных образцов тканей для переноса в удаленный участок для анализа анализа кометы была изучена полезность опубликованного метода6 сохранения тканей из флэш-замороженных кубов ткани. В этом методе замороженные кубики ткани загружаются в устройство для измельчения тканей из нержавеющей стали(рисунок 1), которое помещается в микроцентрифугную трубку, содержащую холодный буфер. Куб ткани затем проталкивается через небольшую калибровочная сетка в конце устройства. Неоднократное принуждение ткани суспензии через сеточное сито в обоих направлениях несколько раз приводит к относительно равномерной одноклеточной суспензии. Образцы, подготовленные этим методом, по качеству сравнивали как со свежими, так и с замороженными образцами тканей, подготовленными путем измельчения. В качестве дополнительного преимущества, в отличие от фарша, кубики тканей могут храниться замороженными в течение длительных периодов времени и по-прежнему дают высокие результаты качества в анализе кометы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как было продемонстрировано ранее7,12,13, правильно обрабатываются флэш замороженных фарш ткани обеспечивает хорошие результаты в анализе кометы. В самом деле, базовые % хвост днк значения для замороженных фарш крысиной и мышиной печени,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы в долгу перед Линкольном Мартином и Келли Оуэнсом за экспертную техническую помощь в подготовке и скоринге кометных слайдов и доктору Кэрол Шварц за выполнение статистического анализа. Авторы также признают поддержку вклада членов генетической токсикологии, исследования токсикологии и некропсии программ в ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
