DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı
Summary
Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.
Abstract
Kuyruklu yıldız tsay, özellikle kimyasallara veya diğer çevresel strese maruz kaldıktan sonra, kültürlü hücre ve dokularda DNA hasarını değerlendirmek için bir araç olarak popülerlik kazanıyor. Kemirgenlerdeki genotoksik potansiyel için yapılan düzenleyici testlerde kuyruklu yıldız titrelerinin kullanımı, 2014 yılında Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) test kılavuzunun benimsenmesi ile yürütülmüştür. Kuyruklu yıldız asa slaytları genellikle nekropsi sırasında taze dokudan hazırlanır; ancak, dondurucu doku örnekleri hayvan başına birden fazla organdan ve çalışma başına birçok hayvandan slaytların eşzamanlı hazırlanması ile ilişkili lojistik zorlukları önleyebilir. Donma aynı zamanda maruz kalma tesisinden analiz için farklı bir laboratuvara numune lerin sevkiyatını sağlar ve dondurulmuş dokunun depolanması, belirli bir organ için DNA hasar verileri oluşturma kararının ertelenmesini kolaylaştırır. Alkali kuyruklu yıldız testi, pozlamaya bağlı DNA çift ve tek iplikçikli kırıkları, alkali-labile lezyonlarını ve eksik DNA eksizyonu onarımı ile ilişkili iplikçik kırıklarını tespit etmek için yararlıdır. Ancak, DNA hasarı da mekanik kesme veya yanlış numune işleme prosedürleri, tahsin sonuçları kafa karıştırıcı neden olabilir. Nekropsiler sırasında doku örneklerinin toplanması ve işlenmesinde tekrarlanabilirlik, kuyruklu yıldız tadına göre dokuların hasat edilmesinde farklı düzeyde deneyime sahip laboratuvar personelinin dalgalanması nedeniyle kontrol edilmesi zor olabilir. Deneyimli laboratuvar personeliyle çalışan tazeleme eğitimi veya mobil ünitelerin konuşlandırılması yoluyla tutarlılığın artırılması maliyetlidir ve her zaman mümkün olmayabilir. Kuyruklu yıldız tahlil analizi için yüksek kaliteli örneklerin tutarlı nesil optimize etmek için, özelleştirilmiş doku kıyma cihazı kullanarak doku flaş dondurulmuş küpleri homojenleştirme için bir yöntem değerlendirildi. Bu yöntemle kuyruklu yıldız tadına göre hazırlanan numuneler, nekropsi sırasında kıyma ile hazırlanan taze ve dondurulmuş doku örnekleriile kalite açısından olumlu karşılaştırılabı. Ayrıca, uzun süreli depolandıktan sonra dondurulmuş doku küplerinden hücrelerde düşük bazsatır DNA hasarı ölçüldü.
Introduction
Kuyruklu yıldız tsay giderek kimyasallar veya diğer çevresel stres 1 maruz kültürlü hücre ve dokularda DNA hasarı değerlendirmek için bir araç olarakkullanılır. Titrek, DNA çift ve tek iplikçikli sonları, alkali-labile lezyonlarını ve eksik DNA onarımı ile ilişkili tek iplikçikli sonları tespit edebilir. Farmasötik testler için Farmasötik Ürünler için Teknik Gerekliliklerin Uyumlaştırılması Uluslararası Konseyi (ICH) farmasötik testler için kılavuz, kemirgen eritrosit mikronükleus testini sağlamak için ikinci bir test olarak kuyruklu yıldız testi gibi bir DNA iplikçik kırılması testi önerir ve tümör indüksiyonu hedef organlarında eylem modunu değerlendirmek için bir takip testiolarak 2. Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) in vivo kuyruklu yıldız testi bir in vitro genotoksisite testi olumlu bir sonucun alaka araştırmak için uygun bir takip testi olarak önerir3. 2014 yılında, kemirgen kuyruklu yıldız testi için bir OECD test kılavuzu onaylanarak, genotoksik potansiyelin düzenleyici testlerinde kullanılmak üzere testin kabul edilebilirliği artırıldı. Test, sakinleştirilmiş DNA döngüleri ve lized hücrelerin çekirdeklerinden göç eden parçaların elektroforetik olarak ayrılmasına dayanır. Temel olarak, tek hücreler mikroskop slaytlar üzerine katmanlı olmuştur agarose gömülüdür. Slaytlar daha sonra bir alkalin (pH > 13) çözeltisi, sıkıca sarılmış nükleer DNA dinlenmek ve gevşemek için izin veren bir lysis tampon batırılır. Slaytlar daha sonra bir elektrik alanına yerleştirilir, bu da negatif yüklü DNA’nın atota doğru göçüne neden olur ve kuyruklu yıldıza benzeyen görüntüler oluşturur; kuyruklu yıldız kuyruğundaki göreceli DNA miktarı, kuyruklu yıldız kafasıyla karşılaştırıldığında DNA hasarının miktarıyla doğru orantılıdır; Kuyruktaki DNA içeriği genellikle dijital görüntüleme yazılımı kullanılarak ölçülür.
Kuyruklu yıldız testi parçalanmış DNA’yı algıladığı için, maruziyete bağlı DNA hasarının doğru niceliği, tedaviye bağlı sitotoksisite veya stresten kaynaklanan nekroz veya apoptozla ilişkili kromatin parçalanması yla şaşırtılabilir. Ayrıca, DNA hasarı mekanik kesme veya yanlış numuneişleme4 sonucu oluşabilir. Dna hasarının temel düzeyini en aza indirmek için slayt hazırlama öncesinde soğutulmuş hasat doku bakımının önemi daha önce gösterilmiştir5,6. Birçok laboratuvar taze dokudan kuyruklu yıldız adaçayı slaytları hazırlar; ancak, bu çok sayıda hayvan ile yapılan bir çalışmada hayvan başına birden fazla doku türünden slaytlar hazırlarken lojistik zor olabilir. Ayrıca, bu durum, uzak bir laboratuvarda slayt hazırlama ve analizlerin yapılacağı ve numunelerin sevkiyatının gerekli olduğu bir sorun teşkil ediyor. Örneğin, ABD Ulusal Toksikoloji Programı, genetik toksikoloji test programının bir bileşeni olarak kuyruklu yıldız tökezlemeyi içerir (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ve bazen 28 veya 90 gün tekrar doz toksisite çalışmaları içine test içerir; bu, dokuların yaşam içi laboratuvar tarafından toplanmasını ve numunelerin analiz için başka bir laboratuvara aktarılmasını gerektirir. Bunu başarmak için, doku parçaları kıyılmış ve / veya gastrointestinal sistem epitel hücreleri kazınmış ve hücresel süspansiyonlar dondurulmuş ve analiz7kadar alıcı laboratuvar tarafından sonraki sevkiyat ve depolama için bir dondurucuda saklanır . Numunelerin doğru şekilde işlenmesi, dondurulmuş doku kullanılarak yüksek kaliteli veri elde edilmesi için çok önemlidir; ancak, sürekli değişen personel tarafından gerçekleştirilen nekropsiler sırasında doku örneklerinin tekrarlanabilir manipülasyonu kontrol etmek zordur, özellikle kuyruklu yıldız tayı için rutin olarak doku hasat olmayan yaşam laboratuvarlarında. Nekropsi personelinin tazelemesi eğitimi veya deneyimli laboratuvar personeli tarafından taze veya dondurulmuş doku örnekleri toplamak için personele ait bir mobil ünitenin kullanımı genellikle çok maliyetlidir, mümkün değildir veya sadece küçümsenmez.
Kuyruklu yıldız tahlil analizi için uzak bir bölgeye transfer için yüksek kaliteli doku örnekleritutarlı nesil sağlamak için, doku flash dondurulmuş küpleri doku koruma yayınlanan bir yöntem6 programı araştırıldı. Bu yöntemde, dondurulmuş doku küpleri, soğuk tampon içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilen paslanmaz çelik doku kıyma cihazına(Şekil 1)yüklenir. Doku küpü daha sonra cihazın sonunda küçük bir ölçer örgü ile itilir. Tekrar tekrar her iki yönde de örgü elek yoluyla doku süspansiyon zorlayarak nispeten düzgün tek hücreli süspansiyon ile sonuçlanır. Bu yöntemle hazırlanan numuneler, kalite olarak hem taze hem de dondurulmuş doku örnekleri ile karşılaştırıldı. Ek bir yararı olarak, kıyma örnekleri aksine, doku küpleri uzun süre dondurulmuş saklanabilir ve hala kuyruklu yıldız tahsini yüksek kaliteli sonuçlar verim.
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce gösterildiği gibi7,12,13, düzgün flaş dondurulmuş kıyma doku ele kuyruklu yıldız tahsiniyi iyi sonuçlar sağlar. Aslında, laboratuarımızda hazırlanan dondurulmuş kıyılmış sıçan ve fare karaciğeri için temel % kuyruk DNA değerleri, yeni kıyılmış fare karaciğeri örnekleri için OECD test rehberi9 tarafından tavsiye edilen genellikle ≤%6’dır. Dondurulmuş olarak d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar lincoln Martin ve Kelley Owens uzman teknik yardım hazırlanması ve kuyruklu yıldız slaytlar ve Dr Carol Swartz istatistiksel analizler yapmak için puanlama için borçlubulunmaktadır. Yazarlar ayrıca ILS’de Genetik Toksikoloji, Araştırmacı Toksikoloji ve Nekropsi programlarının üyelerinin destekleyici katkılarını kabul etmektedirler.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
