Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN
Summary
Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.
Abstract
L’essai de comète gagne en popularité comme moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules et les tissus cultivés, en particulier après l’exposition à des produits chimiques ou à d’autres facteurs de stress environnementaux. L’utilisation de l’analyse de la comète dans les essais réglementaires pour le potentiel génotoxique chez les rongeurs a été motivée par l’adoption d’une ligne directrice d’essai de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) en 2014. Les diapositives d’analyse de comète sont généralement préparées à partir de tissus frais au moment de l’autopsie; cependant, la congélation d’échantillons de tissus peut éviter les problèmes logistiques associés à la préparation simultanée de diapositives à partir de plusieurs organes par animal et de nombreux animaux par étude. La congélation permet également d’expédier des échantillons de l’installation d’exposition à un autre laboratoire pour analyse, et le stockage des tissus congelés facilite le report d’une décision de générer des données sur les dommages à l’ADN pour un organe donné. L’essai de comète alcalin est utile pour détecter les ruptures d’ADN à double brin et à brin liés à l’exposition, les lésions alkali-labile, et les ruptures de brin associées à la réparation incomplète d’excision d’ADN. Cependant, les dommages à l’ADN peuvent également résulter de la tonte mécanique ou des procédures de traitement inadéquates de l’échantillon, confondant les résultats de l’essai. La reproductibilité dans la collecte et le traitement des échantillons de tissus pendant les nécropsies peut être difficile à contrôler en raison de la fluctuation du personnel de laboratoire avec des niveaux variables d’expérience dans la récolte des tissus pour l’essai de la comète. Il est coûteux d’améliorer la cohérence grâce à une formation de recyclage ou au déploiement d’unités mobiles dotées d’un personnel de laboratoire expérimenté et n’est pas toujours possible. Pour optimiser la génération constante d’échantillons de haute qualité pour l’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’essai de comète, une méthode pour homogénéiser des cubes de tissu congelés flash à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire personnalisé a été évaluée. Des échantillons préparés pour l’analyse de la comète par cette méthode ont comparé favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés en mâmant pendant l’autopsie. En outre, de faibles dommages à l’ADN de base ont été mesurés dans les cellules des cubes congelés de tissu après stockage prolongé.
Introduction
L’essai de comète est de plus en plus utilisé comme un moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules cultivées et les tissus exposés à des produits chimiques ou d’autres facteurs de stress environnementaux1. L’essai peut détecter des ruptures d’ADN à deux brins et à un brin, des lésions alkali-labile, et des ruptures à brin unique associées à la réparation incomplète de l’ADN. Le Conseil international pour l’harmonisation des exigences techniques pour les produits pharmaceutiques à usage humain (ICH) recommande un analyse de rupture de brin d’ADN tel que l’analyse de la comète comme un deuxième test pour compléter l’essai de micronuclée érythrocyte rongeur pour évaluer la génototoxicité in vivo et comme un test de suivi pour évaluer le mode d’action dans les organes cibles de l’induction tumorale2. L’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) recommande l’analyse de la comète in vivo comme un test de suivi approprié pour étudier la pertinence d’un résultat positif dans un test de génototoxicité in vitro3. En 2014, une ligne directrice d’essai de l’OCDE a été approuvée pour l’essai de la comète rongeur, augmentant ainsi l’acceptabilité de l’essai pour l’utilisation dans les essais réglementaires du potentiel génotoxique. L’essai est basé sur la séparation électrophorétique des boucles d’ADN détendues et des fragments qui migrent des nucléoïdes des cellules lysed. Fondamentalement, les cellules simples sont incorporées dans l’agarose qui a été superposée sur des lames de microscope. Les diapositives sont ensuite immergées dans un tampon de lyse suivi d’une solution alcalin (pH et 13), qui permet à l’ADN nucléaire étroitement enroulé de se détendre et de se détendre. Les diapositives sont ensuite placées dans un champ électrique, ce qui stimule la migration de l’ADN chargé négativement vers l’anode, créant des images qui ressemblent à des comètes; la quantité relative d’ADN dans la queue de la comète par rapport à la tête de la comète est directement proportionnelle à la quantité de dommages à l’ADN; Le contenu de l’ADN dans la queue est généralement quantifié à l’aide d’un logiciel d’imagerie numérique.
Étant donné que l’analyse de la comète détecte l’ADN fragmenté, la quantification précise des dommages causés par l’ADN induit par l’exposition peut être confondue par la fragmentation de la chromatine associée à la nécrose ou à l’apoptose résultant d’une cytotoxicité ou d’un stress induit par le traitement. En outre, des dommages à l’ADN peuvent se produire à la suite d’une tonte mécanique ou d’un traitement inadéquat de l’échantillon4. L’importance de maintenir le tissu récolté réfrigéré avant la préparation de la diapositive pour minimiser le niveau de base des dommages à l’ADN a été démontrée précédemment5,6. De nombreux laboratoires préparent des glissades d’essai de comètes à partir de tissus frais; cependant, cela peut être difficile sur le plan logistique lors de la préparation de diapositives de plusieurs types de tissus par animal dans une étude avec un grand nombre d’animaux. De plus, cela pose un problème lorsque la préparation et l’analyse des diapositives doivent se produire dans un laboratoire éloigné, ce qui nécessite l’expédition d’échantillons. Par exemple, le Programme national de toxicologie des États-Unis comprend l’analyse de la comète comme élément de son programme de tests toxicologiques génétiques (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) et intègre parfois l’essai dans des études de toxicité de 28 ou 90 jours de dose de répétition; cela nécessite la collecte de tissus par le laboratoire de la vie et le transfert d’échantillons à un autre laboratoire pour analyse. Pour ce faire, les morceaux de tissus sont hachés, et / ou les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal sont grattés et les suspensions cellulaires sont flash congelés et stockés dans un congélateur pour l’expédition ultérieure et le stockage par le laboratoire de réception jusqu’à l’analyse7. Une bonne manipulation des échantillons est cruciale pour obtenir des données de haute qualité à l’aide de tissus congelés; cependant, la manipulation reproductible des échantillons de tissus pendant les autopsies exécutées par le personnel en constante évolution est difficile à contrôler, particulièrement dans les laboratoires dans la vie qui ne récoltent pas systématiquement des tissus pour l’essai de comète. La formation de recyclage du personnel de autopsie ou l’utilisation d’une unité mobile composée de personnel de laboratoire expérimenté pour recueillir des échantillons de tissus frais ou congelés est souvent trop coûteuse, pas faisable, ou tout simplement sous-évaluée.
Pour mieux assurer une génération constante d’échantillons de tissus de haute qualité pour le transfert vers un site éloigné pour l’analyse des analyses d’analyses d’analyses d’analyses de comètes, l’utilité d’une méthode publiée6 de préservation des tissus à partir de cubes de tissu congelés flash a été explorée. Dans cette méthode, des cubes de tissu congelés sont chargés dans un dispositif de mâchage des tissus en acier inoxydable(figure 1) qui est placé dans un tube de microcentrifuge contenant un tampon froid. Le cube de tissu est ensuite poussé à travers un petit maillage de jauge à l’extrémité de l’appareil. Forcer à plusieurs reprises la suspension de tissu par le tamis de maille dans les deux directions résultats plusieurs fois dans une suspension relativement uniforme de cellule simple. Les échantillons préparés par cette méthode comparaient favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés par le mincing. Comme avantage supplémentaire, contrairement aux échantillons hachés, les cubes de tissu peuvent être stockés congelés pendant de longues périodes de temps et donnent encore des résultats de haute qualité dans l’essai de la comète.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme démontré précédemment7,12,13, correctement manipulé flash congelé tissu haché fournit de bons résultats dans l’essai de la comète. En fait, les valeurs d’ADN de queue de base pour les rats hachés congelés et le foie de souris préparés dans notre laboratoire sont généralement de 6 %, comme le recommande la ligne directricede l’OCDE pour les échantillons de foie de rat fraîcheme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont redevables à Lincoln Martin et Kelley Owens pour une assistance technique experte préparant et marquant des diapositives de comète et le Dr Carol Swartz pour avoir effectué des analyses statistiques. Les auteurs reconnaissent également les contributions de soutien des membres des programmes de toxicologie génétique, de toxicologie d’enquête et d’autopsie à l’ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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